[發(fā)明專利]重組人可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310171830.6
• 申請日: 2013-05-06
• 公開（公告）號: CN103255160A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐霞;李雪燕;蔡媛媛
• 申請（專利權(quán)）人: 徐霞
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種重組人可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的制備方法，其包括如下步驟：使用上游引物(5’-CG?GGA?TCC?GTG?AGA?GAA?AGA?GGT?C-3’)和下游引物(5’-CCC?CCA?GGT?CAG?TTA?GC-3’)，以TRAIL全長cDNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物記為TRAIL_114-281；

將TRAIL_114-281和載體pET-28a(+)使用限制性內(nèi)切酶BamH?I和Hind?III雙酶切回收后連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-TRAIL_114-281，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli?DH5α中，通過酶切鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，將測序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TRAIL_114-281轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，接種到含卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；次日將過夜的菌液接種于LB中，加入卡那霉素，36-38℃培養(yǎng)，當(dāng)菌體密度OD值為0.5-0.7時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG和硫酸鋅，24-26℃培養(yǎng)3-5h，取出菌液，離心收獲濕菌；

濕菌加入包含8-12％甘油，0.3-0.6mol/L?NaCl，10-30mmol/L?tris-Hcl，4-6mmol/L?DTT，0.5-1.5mmol/L?PMSF的緩沖溶液，超聲裂解細(xì)菌，離心，收獲上清，過濾除去雜質(zhì)，加入咪唑使其終濃度為15-25mmol/L，采用親和層析法鎳柱純化TRAIL蛋白，用400-600mmol/L咪唑溶液洗脫，收集洗脫液并置于PBS緩沖液中0-4℃透析過夜，次日收集即為純化后的TRAIL蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，所述的TRAIL蛋白具有24-26kDa左右的分子量。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，所述的誘導(dǎo)劑IPTG和硫酸鋅的誘導(dǎo)濃度為0.8-1.2mmol/L。