[發明專利]一種快速檢測黃牛SIRT1基因SNP的RFLP方法

有效

• 申請號: 201310169313.5
• 申請日: 2013-05-06
• 公開（公告）號: CN103290113A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 陳宏;李明勛;孫曉梅;藍賢勇
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子遺傳學領域，具體涉及一種快速檢測沉默調節因子1(SIRT1)基因單核苷酸多態性(SNP)的RFLP（限制性片段長度多態性）方法，具體地說，是一種利用限制性內切酶對包含該單核苷酸多態性位點的基因序列進行酶切，根據瓊脂糖凝膠電泳對其進行片段大小分離，利用凝膠成像系統分析其片段大小，從而確定其SNP。

背景技術

單核苷酸多態性（SNP）就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸（A/T/C/G）的替換而引起的多態性。SNP屬于第三代分子標記，具有密度高、雙等位基因、易實現自動化檢測等優點，由于SNP具有其它標記無比擬的優點，所以它作為一種研究工具已經在生命科學的各個領域得到廣泛應用。

近年來，人們發展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP)、直接測序技術和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁瑣、耗時長，結果易造成誤判，而直接測序技術成本又較高。PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點后使用限制性內切酶進行酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。

SIRT1是酵母染色質沉默因子SIR2（silent?information?regulator2）的哺乳動物同源體，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的組蛋白脫乙酰酶。SIRT1在成熟組織中廣泛表達，在胚胎早期和生殖細胞中含量尤其豐富，參與調節機體內許多生理功能，包括眾多基因轉錄、能量代謝以及細胞衰老過程的調節等，尤其在糖代謝、脂代謝、調節胰島素分泌中發揮著重要的作用。在脂肪組織中SIRT1負調控白色脂肪細胞中的過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome?proliferators?activated?receptors，PPARγ)，促進脂肪動員。在成肌細胞中，降低內源SIRT1導致肌細胞標志基因表達增加，促進肌細胞分化。對于黃牛育種來講，分析SIRT1基因在牛脂肪代謝及肌肉分化中的機制，對于提高黃牛的育肥效率、提高肉品質具有重要的理論意義。

目前國內外未見關于牛SIRT1基因遺傳變異的研究，由于SIRT1基因功能涉及脂肪代謝及肌肉分化等重要生長性狀，本發明提供的檢測方法為SIRT1基因的SNP與中國黃牛生長性狀關系的建立奠定了基礎，以便用于中國黃牛生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。

發明內容

本發明解決的問題在于利用PCR-RFLP方法檢測黃牛SIRT1基因啟動子區的單核苷酸多態性，分析其對SIRT1基因啟動子活性的影響，并將其與生長性狀進行關聯分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記，從而加快良種選育速度。

本發明是通過以下技術方案來實現：

以黃牛血液全基因組DNA為模板，在Taq?DNA聚合酶、Buffer(緩沖環境)、Mg^2＋、dNTPs存在的情況下，利用引物F、R進行PCR擴增，然后用限制性內切酶對其進行酶切，再通過3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測即可鑒定SIRT1基因轉錄起始位點上游274位（-274位，即SEQ?ID?NO.1第127位）的單核苷酸多態性。

所述的PCR擴增引物為：

上游引物F：5′-GTATAGTCCACGGGGTTACAG-3′，

下游引物R：5′-CCAAACTTGTCTTTCAGAGTC-3′。

所述的PCR擴增條件是:25μL反應體系包括1U?Taq?DNA聚合酶(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25M?MgCl₂1.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mM?dNTPs2.5μL，50ng黃牛血液基因組DNA，10μM的上、下游引物各0.25μL和滅菌超純水15.0μL；

所述的PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33個循環；72℃延伸10min；

所述的限制性內切酶為SmaI，10μL?SmaI酶切體系為：權利要求2中的PCR產物5μL，10×T?Buffer1.0μL，0.1%BSA1.0μL，SmaI(10U/μL)0.5μL，ddH₂02.5μL，酶切消化條件：30℃恒溫水浴5～8h。

所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為3.0%。