[發(fā)明專利]羊牙齒組織總RNA的提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310166104.5
• 申請日: 2013-05-08
• 公開（公告）號: CN103255134A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓天龍;李志明;王敏;趙瑞霞;毛冉;張艷明
• 申請（專利權(quán)）人: 赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 赤峰市專利事務(wù)所 15103
• 代理人: 劉峰

1.一種羊牙齒組織總RNA的提取方法，其特征在于：它由如下步驟組成：

A、用具及耗材的滅菌處理：減少外源RNase污染，將所有實驗用具及耗材都先用0.1%的DEPC水浸泡24?h；實驗耗材再經(jīng)高壓滅菌處理；

B、樣本采集與清洗：迅速拔取牙齒后，用滅菌手術(shù)刀刮凈附著

的牙齦等軟組織及草垢，再以4℃滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；

C、低溫破碎：沖洗后的牙齒用滅菌濾紙吸干水分，迅速放入液氮中進行低溫冷凍處理，使得牙齒組織脆化而易于破碎，冷凍24～48?h后取出牙齒，用滅菌錫箔紙或紗布包裹牙齒，用滅菌處理過的鐵錘，在液氮存在的情況下，迅速砸碎牙齒；

D、液氮研磨：收集鐵錘砸碎的牙齒碎塊到預(yù)先盛有液氮的研缽中，進行研磨；研磨過程中要及時補充液氮；研磨10～15?min，一般臼齒研磨10～12?min，切齒研磨15?min；

E、裂解細(xì)胞：收集研磨好的牙齒組織粉末80～250?mg，加入到預(yù)先加有1～1.2?ml裂解液的預(yù)冷5?ml離心管中，于冰上靜置20?s；

F、間歇式勻漿：選擇在冰浴下采用內(nèi)切式勻漿機進行，轉(zhuǎn)速3000?r/min，間歇性勻漿2～3?min；

G、分離DNA和蛋白質(zhì)：將勻漿完成的裂解液混合物，轉(zhuǎn)入2.0?ml的離心管中，25℃溫浴靜置5?min，以使核蛋白體完全分解；加入0.2～0.25?ml氯仿，蓋緊蓋子置于旋渦振蕩器上小幅度振蕩15s，25℃溫浴靜置3?min；在溫度為4℃條件下，以12000?g的離心力高速冷凍離心15?min，使混合物分離成三層；

H、沉淀RNA：收集上層無色的水樣層至一新的離心管中，加入0.5?ml異丙醇，用手搖動使其混勻，25℃溫浴靜置10?min；在4℃下以12000?g的離心力高速冷凍離心10?min，可見離心管底部附著一膠狀小片沉淀即為RNA；

I、洗滌RNA：移去上層懸液，加入1?ml?75%乙醇溶液，旋渦振蕩洗脫，至片狀沉淀飄起，在4℃下以7500?g的離心力高速冷凍離心5?min；

J、RNA再溶解：棄去上清液，在超凈工作臺中自然干燥RNA沉淀5～10?min，加入10?μl的0.1%DEPC處理水，于55～60℃下進行金屬浴加熱10?min；提取的總RNA分裝后保存于－80℃。