[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻幼苗轉(zhuǎn)基因方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310161865.1
• 申請日: 2013-05-06
• 公開（公告）號: CN103233039A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘大仁;符雷;周以飛;朱秋強
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因方法，特別涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻幼苗轉(zhuǎn)基因方法。

背景技術(shù)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究最早始于1986?年，Babat等通過PEG?法將農(nóng)桿菌原生質(zhì)球與水稻原生質(zhì)體融合，獲得了部分能夠合成胭脂堿的水稻愈傷組織。1992?年Chan以成熟胚、離體根為起始材料進行研究，但未能獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。l993～1994?年，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究取得了重大突破，Chan?等首次通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，隨后，Hiei?等實現(xiàn)了對粳稻的高頻轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達到28.6％，表明粳稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系已基本建立起來，該研究同時也證明水稻盾片是良好的外植體來源，且農(nóng)桿菌攜帶的雙元載體能夠明顯提高粳稻比如越光稻的轉(zhuǎn)化頻率。此后的十幾年，農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究得到了迅速發(fā)展。Rashid?等將農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)秈稻Basmati370?水稻取得成功，且發(fā)現(xiàn)乙酰酊香酮在共培養(yǎng)階段是必不可少的。Dong?等報道農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化在爪哇稻Gulfmont?和Jefferson?上取得成功；Hoque?等于2005?年建立了適合于孟加拉秈稻種質(zhì)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，并證明水稻幼胚作為外植體較成熟胚有更高的轉(zhuǎn)化率，共培養(yǎng)時間為3d?最優(yōu)；Hiei?和Komari2006?年建立了一套適合秈稻I?群體的高效轉(zhuǎn)化體系，證實轉(zhuǎn)化效率與凝膠劑的種類和共培養(yǎng)基成分密切相關(guān)。林擁軍等建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻品種牡丹江8號的高效轉(zhuǎn)基因體系。王逸群等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將高賴氨酸蛋白基因?qū)氲焦榷拑捎盟局校珿US?組織化學(xué)染色、PCR?擴增、Southern?雜交等分析都表明，該基因已經(jīng)整合到水稻基因組中；他們對9?株轉(zhuǎn)基因水稻葉片賴氨酸含量進行測量，發(fā)現(xiàn)大部分植株的賴氨酸含量都有明顯的提高，最高幅度達到了22.71%。胡昌泉和蘇軍等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將胚乳特異性表達谷蛋白1（Glutelin1，Gtl）基因控制下的可溶性淀粉合成酶基因SSS導(dǎo)入秈稻恢復(fù)系明恢86，共獲得53?個獨立轉(zhuǎn)化再生植株，PCR?檢測表明，sss基因已整合進水稻的基因組中。直鏈淀粉含量測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株后代直鏈淀粉含量較對照有較大幅度的下降；胡利華，吳慧敏等利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將檸檬酸合成酶（citrate?synthase）基因CS?導(dǎo)入雜交秈稻優(yōu)良恢復(fù)系明恢86，共獲得48?株T_0?再生植株，通過分子檢測，證明有陽性植株產(chǎn)生。總的來說，農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化在近十年里取得了顯著進展，不僅為水稻品種的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)，而且為水稻的分子生物學(xué)提供強有力的實驗證據(jù)。

上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因方法，除了PEG融合法外，都是用農(nóng)桿菌浸染水稻愈傷來獲得轉(zhuǎn)基因植株，但是在誘導(dǎo)愈傷組織以及愈傷組織培養(yǎng)中引起的不利變異較大，轉(zhuǎn)化周期較長，且水稻各個品系（品種）間轉(zhuǎn)基因條件也存在較大的差距，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的外源基因待轉(zhuǎn)移到水稻（植物模式植物）中，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸染水稻愈傷的方法存在一些不足，因此，尋找能擺脫組織培養(yǎng)的限制，在自然環(huán)境下大規(guī)模進行水稻轉(zhuǎn)基因的方法十分重要。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻幼苗轉(zhuǎn)基因方法，目的在于提供一種在自然環(huán)境下的水稻轉(zhuǎn)基因方法，能快速獲得轉(zhuǎn)基因植株，進行植物的基因工程改良。該方法可以避免誘導(dǎo)愈傷組織以及愈傷組織培養(yǎng)中引起的不利變異，操作簡單，成本低廉，可以在短時間內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株。

一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻幼苗轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：

（1）試驗材料的栽培：水稻種子用多菌靈浸泡后，置于適宜的容器中，放入恒溫培養(yǎng)箱30℃催芽，當(dāng)水稻芽生長至0.8~1cm時，開始用作試驗受體；

（2）農(nóng)桿菌工程菌轉(zhuǎn)化液的配制：將含有目的基因的農(nóng)桿菌接種到含有篩選壓的液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD₆₀₀值達到0.6~1.0時，離心分離菌體，用含有篩選壓的AAM液體培養(yǎng)基重懸浮，加入乙酰丁香酮和吐溫20，使菌液OD₆₀₀值為2.0~2.5，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液配制完成，待用；

（3）試驗受體的預(yù)處理：在水稻芽生長至0.8~1cm時，用刀片在離胚約1mm處切斷幼苗，用1ml一次性注射器刺傷水稻幼苗的生長點；

（4）農(nóng)桿菌浸染：把（3）預(yù)處理好的材料，馬上放入到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中，25~28℃下用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液浸泡10~12小時，浸染結(jié)束后，把材料移入到泥中，30～33℃光照培養(yǎng)，當(dāng)苗有5cm以上時，移入到到大盆中生長，在生長過程中及時除去分蘗，只留主莖；