[發(fā)明專利]產(chǎn)環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株cd82

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310161167.1
• 申請(qǐng)日: 2013-05-03
• 公開（公告）號(hào): CN104130955B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫謐;郝建華;劉均忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N9/10;C12R1/08
• 代理公司: 北京法思騰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11318
• 代理人: 史和初,楊小蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及海洋微生物領(lǐng)域，特別是涉及從黃海海水中分離篩選出高產(chǎn)環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株cd82及其產(chǎn)生的環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。

背景技術(shù)

環(huán)糊精(Cyclodextrin，CD)是由6個(gè)或更多的D-吡喃型葡萄糖單元通過α-(1-4)-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖。根據(jù)環(huán)中D-吡喃型葡萄糖單元數(shù)目的不同，環(huán)糊精可分為許多種，其中分別由6、7和8個(gè)葡萄糖單元組成的α-、β-和γ-環(huán)糊精最為常見，也稱之為基礎(chǔ)環(huán)糊精。除了基礎(chǔ)環(huán)糊精外，還有比較少見的分別由9、10、11和12個(gè)葡萄糖單元組成的δ-、ξ-、ζ-和η-環(huán)糊精。環(huán)糊精具有圓筒形空心結(jié)構(gòu)，可容納化合物分子。其空腔外表面具有親水性，內(nèi)表面卻具有疏水性，這一特性使得環(huán)糊精及其衍生物在食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥和環(huán)保等領(lǐng)域廣泛用作添加劑或包埋材料，其中尤以β-環(huán)糊精的應(yīng)用最為廣泛。目前我國環(huán)糊精的實(shí)際產(chǎn)量約有4萬噸左右，其中90％的產(chǎn)量被用于其他工業(yè)用途，如食品行業(yè)中作為稠化劑、紡織工業(yè)用輔料和香妝品工業(yè)等等。而環(huán)糊精更具有開發(fā)前景的用途是作為藥物分子的包埋劑，可將一些難溶藥物加工成可溶性藥物制劑。

環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)可作用于淀粉類物質(zhì)產(chǎn)生CD，目前主要應(yīng)用軟化芽孢桿菌、嗜熱脂肪桿菌、巨大芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌等微生物在嚴(yán)格控制的條件下進(jìn)行液體深層發(fā)酵來制備。我國CD的生產(chǎn)和應(yīng)用史已有30多年，但CGTase生產(chǎn)菌種的酶產(chǎn)量不理想，導(dǎo)致了CD的生產(chǎn)成本過高而應(yīng)用受到限制。因此，選育CGTase高產(chǎn)菌是我國酶制劑研究的一項(xiàng)重要任務(wù)。

隨著海洋生物技術(shù)的發(fā)展，人們意識(shí)到開發(fā)海洋資源的重要性。海洋微生物為適應(yīng)海洋各種極端環(huán)境，其產(chǎn)生的酶表現(xiàn)出獨(dú)特的生理功能與酶學(xué)特性，比來自陸源微生物的酶更具開發(fā)應(yīng)用潛力，越來越引起世界各國的重視，爭(zhēng)相開發(fā)、尋找具有全新性質(zhì)的酶已成為國際酶制劑研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于尋找生存在自然環(huán)境中特別是在極端環(huán)境條件下高產(chǎn)高活性環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物，經(jīng)發(fā)明人廣泛深入開發(fā)研究，在對(duì)黃海海水中微生物進(jìn)行分離篩選基礎(chǔ)上，獲得一株具有高效催化能力的高產(chǎn)高活性環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株Bacillussp.cd82（簡(jiǎn)稱菌株cd82）。

本發(fā)明提供的高產(chǎn)環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株cd82是從黃海海水中分離篩選獲得的高產(chǎn)高活性環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株，根據(jù)海洋微生物菌株cd82的16SrDNA序列相似性比對(duì)，cd82的16SrDNA與Bacillusalkalitolerans有99%的同源性。菌株cd82的GenBanK登錄號(hào)為KC928273，鑒定確定為芽孢桿菌屬的細(xì)菌，是Bacillus的新菌株。該高產(chǎn)環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株Bacillus?sp.cd82于2013年4月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)：CCTCCNo：M2013155。

菌株cd82的篩選

初篩：取10ml水樣，加入到90ml無菌水中進(jìn)行梯度稀釋，取30μl10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的懸液涂布基礎(chǔ)培養(yǎng)基(所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基（wt）：蛋白胨1%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，NaCl0.5%，固體另加2%瓊脂，調(diào)至pH7.0，115℃高壓蒸汽滅菌30min)平板中，35℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h；固體篩選平板分為8個(gè)小格，把基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上形態(tài)大小不同的單菌落依次挑取點(diǎn)接入小格中，30℃培養(yǎng)箱篩選用培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后觀察透明圈的大小(所述篩選用培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，K₂HP0₄1g，MgSO₄·7H₂O0.2g，Na₂CO₃5g，酚酞O.3g，甲基橙0.1g，瓊脂15g，121℃滅菌15min，自然pH值。環(huán)狀糊精與甲基橙和酚酞染料反應(yīng)形成復(fù)合物，可在培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)黃色透明圈,將黃色透明圈較大的菌落反復(fù)傳代培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)菌株，接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基斜面內(nèi)，4℃冰箱保存。