[發(fā)明專利]一種吡利霉素的殘留分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310159490.5
• 申請(qǐng)日: 2013-05-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103424478A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁宗輝;陶燕飛;陳冬梅;潘源虎;王玉蓮;黃玲利;王旭;劉振利;謝書宇;彭大鵬;戴夢(mèng)紅;郝海紅;程古月
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸藥殘留分析技術(shù)領(lǐng)域，與分析化學(xué)有關(guān)，本發(fā)明具體涉一種標(biāo)識(shí)化合物吡利霉素吡利霉素殘留的分析方法，本發(fā)明利用氯甲酸-9-芴基甲酯為衍生試劑與含仲胺基的吡利霉素藥物通過(guò)柱前衍生化方法，HPLC方法聯(lián)測(cè)，判定待測(cè)動(dòng)物制品中標(biāo)識(shí)化合物吡利霉素的殘留水平。

背景技術(shù)

吡利霉素是一種獸用的抗生素類藥物，不溶于水，其鹽酸鹽溶于甲醇、丙二醇，微溶于水。鹽酸鹽含有1個(gè)結(jié)晶水，為白色或類白色粉末，分子式為C₁₇H₃₁ClN₂O₅S·HCl·H₂O，分子量465.43，化學(xué)名為(2S-順式)-甲基7-氯-6，7，8-三脫氧-6-[[(4-乙基-2-吡啶基)羰基]氨基]-1-硫代-L-蘇式-α-D-半乳-辛吡喃糖苷單鹽酸鹽一水合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

吡利霉素(Pirlimycin)由美國(guó)Upjohn公司研制的動(dòng)物專用林可胺類抗生素。該藥在我國(guó)已于2007年獲批生產(chǎn)使用。抗菌譜與林可霉素、克林霉素相似，抗菌活性與克林霉素相似或較弱，特點(diǎn)是對(duì)G細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌等具有強(qiáng)大的抗菌活性，尤其對(duì)內(nèi)酰胺類耐藥的G細(xì)菌仍有強(qiáng)大的抗菌活性。其作用機(jī)制是與敏感菌的50S核糖體亞單位結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽酶，阻止肽鏈形成，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成。

目前，國(guó)外主要批準(zhǔn)用于敏感菌引起的奶牛乳房炎的治療。毒性研究表明，過(guò)量吡利霉素導(dǎo)致沉郁、腹瀉、痙攣、胃腸道刺激等中毒癥狀，同時(shí)伴有嚴(yán)重的眼刺激和中等程度的皮膚刺激，無(wú)基因毒性、無(wú)致癌性。藥動(dòng)學(xué)研究表明，吡利霉素在體內(nèi)以吡利霉素和吡利霉素亞砜存在，其中吡利霉素為主要成分，故殘留檢測(cè)的標(biāo)識(shí)化合物為吡利霉素。歐盟規(guī)定其在肌肉、牛奶中的MRL值均為100μg/kg、肝臟1000μg/kg、腎臟400μg/kg。關(guān)于吡利霉素殘留的檢測(cè)方法很少，涉及樣品較多的是牛奶，其次為肝臟。其方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜。方法的檢測(cè)限多在2～10ng/mL，回收率為80％左右。國(guó)外HORNISH等使用LC-MS測(cè)定牛奶和肝臟中吡利霉素的殘留，該方法的定量限和檢測(cè)限分別為50和10ng/mL。國(guó)內(nèi)孫雷等采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶中吡利霉素的殘留量，方法檢測(cè)限和定量限分別為2和5ng/mL，回收率在90％以上。目前尚未見(jiàn)高效液相色譜的殘留檢測(cè)方法。

氯甲酸-9-芴基甲酯中含有活性氯基團(tuán)，可以與藥物中的仲胺基相互作用，同時(shí)含有熒光基團(tuán)和較強(qiáng)的紫外吸收。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種標(biāo)識(shí)化合物吡利霉素吡利霉素殘留的分析方法，利用氯甲酸-9-芴基甲酯為衍生試劑與含仲胺基的吡利霉素藥物進(jìn)行柱前衍生化反應(yīng)，然后通過(guò)高效液相色譜(HPLC)方法進(jìn)行分離檢測(cè)，紫外檢測(cè)器測(cè)定表明，含仲胺基的吡利霉素藥物與氯甲酸-9-芴基甲酯反應(yīng)產(chǎn)物的紫外吸收強(qiáng)度高。本發(fā)明的方法靈敏度高，反應(yīng)快速高效，操作簡(jiǎn)便。

本發(fā)明的總體技術(shù)方案如下：

確立仲胺基化合物標(biāo)樣與氯甲酸-9-芴基甲酯進(jìn)行衍生化反應(yīng)的條件→衍生產(chǎn)物高效液相色譜(HPLC)分離檢測(cè)方法的建立→樣本的分析檢測(cè)

具體步驟如下所述：

1.仲胺基化合物與氯甲酸-9-芴基甲酯的衍生化反應(yīng)

將凈化后氮?dú)獯蹈珊蟮臉颖練堅(jiān)右译?-10mL溶解殘?jiān)郎u混勻，取40μL提取液，依次加入80μL?pH＝9.0的0.1mol/L硼酸緩沖液和80μL衍生化試劑(0.01mol/L)，旋渦混勻反應(yīng)3min后經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)。

2.衍生產(chǎn)物HPLC測(cè)定的技術(shù)條件：

色譜柱：Agilent?SB-AqC18柱色譜柱，柱長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm；

柱溫：30℃；

流動(dòng)相：梯度洗脫(A相：0.02mol/L乙酸銨溶液；B相：乙腈)

表1?梯度洗脫程序

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器：266nm；