[發明專利]姬松茸SSR分子標記、其制備方法及在鑒別姬松茸菌株上的應用方法

有效

• 申請號: 201310158060.1
• 申請日: 2013-05-02
• 公開（公告）號: CN103215263A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 劉朋虎;陳堅;肖淑霞;陳愛華;顏孫安;翁伯琦;雷錦桂;王義祥;鄭少玲;江枝和
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院土壤肥料研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 福州市鼓樓區鼎興專利代理事務所(普通合伙) 35217
• 代理人: 傅契克

1.姬松茸SSR分子標記，其特征在于：該分子標記引物的序列如下①引物A?5’-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和5’-CGCCAGTTGTGCACAT-3’；?②引物B?5’-CGCATCTTGGGCTCCTT-3’和5’-GGGGAAGCACGATCGTT-3’；?③引物C?5’-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’和5’-CCCCACGGATTGCC-3’；④引物D?5’-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’和5’-GTGAGTCTGT?GTGTGTGTGAGT-3’。

2.根據權利要求1所述的姬松茸SSR分子標記的制備方法，其特征在于：其包括以下步驟，

???⑴、CTAB?法提取姬松茸基因組DNA：①、稱取0.1g姬松茸Co⁶⁰輻射誘變菌株J2～J66的菌絲或子實體，用去離子水沖洗干凈后，迅速轉入1.5ml離心管中；②、加入液氮，迅速用電鉆搗碎，后加入600mlCTAB?并于65℃水浴1h，并每20min反轉搖勻一次；③、加入等體積調制的氯仿-異戊醇，使步驟（1）②獲得的溶液與氯仿-異戊醇體積比24:1，顛倒混勻后，于12000rpm離心6min，取上清液于新管中；④、向上清液中加入其2倍體積的無水乙醇或其2/3體積的異丙醇，于-20℃放置20min；⑤、步驟（1）④的溶液于12000rpm離心6min，去上清液后，加入75％乙醇清洗DNA于12000rpm離心2min后，再次去上清液；⑥、將步驟（1）⑤制得的DNA風干后加入50μl的TE緩沖液；

???⑵、利用鏈霉素磁珠富集與生物素標記的探針雜交的技術分離姬松茸基因組DNA的SSR微衛星序列并對其測序；

???⑶、針對姬松茸基因組DNA的SSR微衛星序列進行引物設計，并用引物姬松茸基因組DNA進行PCR擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的電泳圖檢測菌株擴增出的特異條帶，從而篩選出能夠通過擴增出的特異條帶進行姬松茸菌株鑒別的SSR分子標記引物：①引物A?5’-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和5’-CGCCAGTTGTGCACAT-3’；?②引物B?5’-CGCATCTTGGGCTCCTT-3’和5’-GGGGAAGCACGATCGTT-3’；?③引物C?5’-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’和5’-CCCCACGGATTGCC-3’；④引物D?5’-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’和5’-GTGAGTCTGT?GTGTGTGTGAGT-3’。

3.根據權利要求1所述的姬松茸SSR分子標記在鑒別姬松茸菌株上的應用方法，其特征在于：其包括以下步驟，

??⑴、用所述姬松茸特異SSR分子標記引物①引物A?5’-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和5’-CGCCAGTTGTGCACAT-3’；?②引物B?5’-CGCATCTTGGGCTCCTT-3’和5’-GGGGAAGCACGATCGTT-3’；?③引物C?5’-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’和5’-CCCCACGGATTGCC-3’；④引物D?5’-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’和5’-GTGAGTCTGT?GTGTGTGTGAGT-3’分別對姬松茸基因組DNA進行PCR反應：PCR反應體系為：25μl的PCR反應體系中包括提取的DNA溶液1μl,10nmol/L引物2μl,其中上下游引物各1μl?，12.5mmol/L?dNTP?2μl,10×PCR?buffer?2.5μl,?Taq?DNA聚合酶1U；PCR反應程序為：94℃預變性7min；隨后30個循環，每個循環94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min；

??⑵、對步驟⑴所得PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色，得到電泳圖片；

??⑶、對PCR產物電泳圖片進行條帶分析，通過以下菌株的特異條帶對菌株品種進行鑒別：①引物A：僅缺243bp條帶鑒別出菌株J22、J26、J29、J30；同時缺224、243bp條帶鑒別出菌株J3、J19、J38、J54；197bp條帶鑒別出菌株J29、J31；②引物B：318bp條帶鑒別出菌株J19；372bp條帶鑒別出菌株J45；389bp條帶鑒別出菌株J65；426bp條帶鑒別出菌株J51；③引物C：244bp條帶鑒別出菌株J14；④引物D：106bp條帶鑒別出菌株J19；201bp條帶鑒別出菌株J45。