[發明專利]一種基因點突變的實時PCR檢測方法及其應用

無效

• 申請號: 201310147662.7
• 申請日: 2013-04-26
• 公開（公告）號: CN103215364A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 周耐明
• 申請（專利權）人: 鎮江盛泰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基因點突變的檢測方法。?

背景技術

隨著人類基因圖譜草圖的公布和各種病原體基因序列的揭示，這都將極大的促進疾病相關基因的結構和功能研究，特別是基因缺失、錯位、突變(有義突變)等與疾病的關系。在眾多導致人類疾病的基因有義突變、病原體亞型以及耐藥基因的有義突變中，單堿基突變占了相當大的比例，其檢測方法的探索一直是基因診斷研究中的重要課題，特別是對已知有義突變的檢測，將是臨床進行基因診斷的重要手段之一。PCR擴增技術問世以來，建立于擴增基礎上的突變檢測技術使檢測靶DNA(目的DNA)含量和/或突變靶序列比例過低、檢測靈敏度不足等難題得以克服，使得分子診斷技術進入了新階段。?

在過去十多年中，曾出現了多種點突變的檢測方法。?

1.經典的PCR-RFLP等點突變的檢測方法。RFLP連瑣分析技術是最早用于分析已知點突變的方法，其檢測特點是：具有較高的特異性，可以確定突變的部位及性質，重復性好。但不足之處是僅適合于多態性的檢測：即突變頻率大于1％才能被檢測到；因此，RFLP分析對于檢測突變的早期，尤其是在野生型遠多于突變型時其敏感性就顯得不足了。?

2.反向限制性位點突變分析(iRSM)：在RFLP分析之前用另一種內切酶對靶序列進行消化，減少了野生型序列的含量(一般消化率＞99％)，因而大大?提高了突變序列的檢出率。但是，由于聚合酶的關系，可能在PCR擴增后導致iRSM分析出現假陽性。?

3.基因芯片具有檢測信息高通量和自動化程度高，一次性檢測可檢出多個位點突變，具有很大的發展潛力，但制備技術要求高。?

4.DNA測序?

Sanger?DNA測序是點突變檢測的金標準。但Sanger測序靈敏度低，測序準備時間長。另一個方法是焦磷酸測序，它的特點是準備時間短，測序也快。但是這兩種方法都需要對PCR產物處理，需要非常小心地防止產物污染。?

5.等位基因特異性擴增?

一個引物的3’端與特定的突變堿基相配，特異性擴增這一突變的片斷，靈敏度高，但一個反應只能檢測一個突變。比如Therascreen?KRAS?RGQ?PCR?Kit，每個樣品做8個PCR反應，也只能檢測7個常見的突變，而KRAS在密碼子12，13上可能的突變是12個。?

6.等位基因區別實時PCR?

在PCR反應中有兩個特異的探針，區別野生型和突變型，靈敏度和特異性都低于特異性擴增，也是一個反應測定一個突變。?

7.熒光PCR檢測點突變?

SYBR?Green?I結合熔解曲線分析點突變簡單、快速、自動化程度較高，易于推廣；但是所用的染料SYBY?Green?I與溴乙啶、YO-PRO-1^[一樣，缺乏序列特異性，因此不可避免的將會降低其敏感性。在擴增過程中產生的非特異性熒光，通常是由引物二聚體和其它污染物的擴增產物引起的，單以熒光很?難將其與靶序列發出的熒光相區分。另外擴增產物堿基序列數較大時，單個堿基置換引起的點突變其Tm變化較小，運用SYBR?Green?I和熔解曲線分析就很難檢出。?

熒光共振能量轉移(fluorescence?resonance?energy?transfer，FRET)結合探針熔解曲線分析點突變。通過對雜交產物穩定性進行實時監測，并結合熔解曲線分析，提高了對點突變檢測的分辨率?

SYBR?Green?I法和FRET法對點突變的檢測均依賴于熔解曲線分析，但存在著諸多限制條件，即：①熔解曲線的相對位置和寬度與所加入的染料濃度及溫度轉換率相關。?

在分子生物學基因點突變的研究中，仍需加強研究，克服上述各方法的不足。?

發明內容

本發明的目的是提供一種快速、簡單、成本低，無PCR產物污染的風險，適用于大批量樣品的檢測，可以精確定位突變位點，所需的DNA樣品量少的基因點突變檢測方法。?

為實現上述放目的，本發明采用如下技術方案：?

一種基因點突變的實時PCR檢測方法，包括以下步驟(1)實時PCR的DNA擴增循環程序；(2)解鏈曲線分析程序，(3)判定所測基因有無突變。?