[發明專利]一種腦膜炎球菌多糖中CTAB含量的測定方法

有效

• 申請號: 201310136134.1
• 申請日: 2013-04-18
• 公開（公告）號: CN103245738A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 王婷婷;魏文進
• 申請（專利權）人: 北京民海生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及測試分析領域，具體地涉及一種利用高校液相色譜測定腦膜炎球菌多糖中CTAB含量的方法。

背景技術

CTAB，全稱為十六烷基三甲基溴化銨，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在多糖純化過程中，CTAB作為螯合劑使復合糖得以沉淀。然而CTAB具有一定的刺激性，可因吸入、咽下或皮膚吸收而使人體受到危害。近年來，在生物制品申報過程中，國家規定應明確CTAB等有機物質殘留量以降低制品風險。因此準確測定腦膜炎多糖原液中CTAB的殘留量對疫苗生產有著重要影響，對疫苗產品質量控制具有重要的意義。

目前，國內外尚無文獻報道腦膜炎球菌多糖原液及腦膜炎球菌多糖疫苗中CTAB殘留量的測定方法，因此如何對腦膜炎球菌多糖疫苗中的CTAB進行檢測尚不確定。

發明內容

本發明目的是提供一種快速而準確的腦膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的測定方法。

為實現本發明目的，提供的測定方法包括以下步驟：

取CTAB標準溶液和腦膜炎球菌多糖溶液樣品，分別上樣于高效凝膠色譜柱，根據色譜圖計算腦膜炎球菌多糖溶液樣品中CTAB的濃度。

具體地，包括以下步驟：

（1）制取CTAB標準溶液作為樣1，其濃度標記為C1；（2）取待檢的腦膜炎球菌多糖溶液，作為樣2；（3）樣1、樣2分別上樣于高效凝膠色譜柱；（4）記錄色譜圖并進行積分計算；（5）根據公式計算樣2中CTAB的濃度。

其中，凝膠色譜柱為TSKgel?G5000色譜柱。其原理是根據樣品分子大小不同進行分離，CTAB與肺炎多糖分子大小間存在差異，可被有效分離。

其中，流動相為（0.8-0.9%）NaCl溶液。

其中，上樣體積分別為20-100μl；洗脫流速為0.4-0.6ml/min。

其中，在檢測波長為214nm下記錄色譜圖。

其中，所述腦膜炎球菌為A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌、Y群腦膜炎球菌、W135群腦膜炎球菌中的任意一種。

其中，根據色譜圖進行積分計算，利用以下公式計算腦膜炎球菌多糖溶液樣品中CTAB的濃度：

將CTAB標準溶液作為樣1，其濃度標記為C1；將待檢的腦膜炎球菌多糖溶液樣品，作為樣2；

根據公式（Ⅰ）計算樣2中CTAB的濃度：

C2=（S2÷S1）×C1，其中，S2為樣2對應的峰面積，S1為樣1對應的峰面積；

根據公式（Ⅱ）計算樣2中CTAB的百分含量：

F=（C2÷C0）×100%，其中，C0為待檢腦膜炎球菌多糖溶液樣品中的多糖濃度。

在本發明優選的實施方案中，檢測腦膜炎球菌多糖中CTAB含量的具體步驟為：

（1）精密制取CTAB標準溶液作為樣1，其濃度標記為C1；

（2）取待檢的腦膜炎球菌多糖溶液，作為樣2；

（3）充分平衡色譜柱后，將樣1上樣于凝膠色譜柱進行洗脫，記錄色譜圖：洗脫峰開始所對應時間標記為t1，洗脫峰結束所對應時間標記為t2；

（4）對樣1色譜圖進行積分，積分窗口為從t1到t2，得到樣1對應的峰面積為S1；

（5）將樣2上樣于高效凝膠色譜柱進行洗脫；

（6）對樣2色譜圖進行積分，積分窗口為從t1到t2，得到樣2對應的峰面積為S2；

（7）根據公式（Ⅰ）：

C2=（S2÷S1）×C1?????????（Ⅰ）

計算樣2中CTAB的濃度；

（8）測定待檢腦膜炎球菌多糖溶液中的多糖濃度，標記為C0；

（9）根據公式（Ⅱ）：

F=（C2÷C0）×100%?????????（Ⅱ）

計算樣2中CTAB的百分含量。

本發明根據CTAB分子與腦膜炎多糖分子間大小存在差異，利用二者在凝膠層析時的保留時間不同，采用高效液相色譜法將CTAB與腦膜炎球菌多糖分離，利用已知濃度的CTAB作為標準對照，從而準確測定腦膜炎球菌多糖原液中CTAB含量。

本發明的有益效果為：本發明提供了一種準確、重復性好、快速、便捷的腦膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的測定方法，當CTAB濃度在6.25-100μg/ml時，線性相關系數r大于0.9990，變異系數CV小于3%，平均回收率在98%以上，從而建立了評價腦膜炎球菌多糖原液質量的新方法。

具體實施方式