[發(fā)明專利]一種法呢基焦磷酸合酶等類酶的活性測(cè)定方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310132760.3
• 申請(qǐng)日: 2013-04-08
• 公開（公告）號(hào): CN104101595A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張巖;陶柏秋;高金波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張巖;陶柏秋;高金波
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及法呢基焦磷酸合酶等類酶的活性測(cè)定方法，屬于酶學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

磷酸或焦磷酸在生物體代謝中有著重要地位，生物體中的很多酶在催化反應(yīng)中利用或產(chǎn)生磷酸或焦磷酸。例如，法呢基焦磷酸合成酶，牻牛兒牻牛兒焦磷酸合酶(GGPPS)，角鯊烯合成酶(SS)，法尼基轉(zhuǎn)移酶(FTase)，牻牛兒牻牛兒轉(zhuǎn)移酶(GGTase)，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MDD)等。這些酶是甲羥戊酸途徑(Mevalonate?pathway)中重要的酶。甲羥戊酸途徑(Mevalonate?pathway)是以乙酰輔酶A為原料合成異戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸的一條代謝途徑，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。該途徑的產(chǎn)物可以看作是活化的異戊二烯單位，是類固醇、類萜等生物分子的合成前體。

目前發(fā)現(xiàn)甲羥戊酸途徑與很多疾病有關(guān)，如心血管疾病、老年癡呆癥、骨質(zhì)疏松癥，癌癥等都直接或間接的與甲羥戊酸有聯(lián)系。所以調(diào)節(jié)甲羥戊酸途徑對(duì)治療這些疾病有重要作用。而抑制這個(gè)途徑中的酶的活性是最直接有效的方法。對(duì)這些酶抑制的藥物開發(fā)得到了廣泛而深入的研究，但這些酶活力的檢測(cè)方法目前主要有發(fā)射性同位素和熒光分光光度方法。前者需要價(jià)格昂貴的放射性底物才可檢測(cè)，并且不可連續(xù)操作，步驟復(fù)雜，對(duì)環(huán)境危害也較大。后者熒光光度方法，需要對(duì)底物進(jìn)行不要而精確的熒光集團(tuán)的修飾而有可能進(jìn)行檢測(cè)，而且對(duì)檢測(cè)體系要求較高，干擾因素較多，準(zhǔn)確度不高，有些體系不適合水溶液操作。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是利用酶比色法技術(shù)檢測(cè)這些酶其一產(chǎn)物磷酸或者焦磷酸的濃度，從而檢測(cè)這些酶的活性。這種方法可方便的制備成試劑盒，利用96板多384板，可高通量的檢測(cè)這些酶的活性，大批量的研究開發(fā)這些酶的抑制劑，檢測(cè)速度快，精度和靈敏度可以和放射同位素方法比擬，比色法檢測(cè)環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)便、干擾因素少，適合切實(shí)的推廣和應(yīng)用。其原理為通過檢測(cè)法呢基焦磷酸合酶等類酶在催化反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸或磷酸的量，得到酶的催化反應(yīng)活性。產(chǎn)生的焦磷酸或者磷酸與酸性化合物試劑反應(yīng)，經(jīng)還原劑還原后得到的有顏色的化合物，比色法檢測(cè)其濃度，用于測(cè)算法呢基焦磷酸合酶等類酶的活性動(dòng)力學(xué)及其用于酶的抑制劑藥物篩選。

具體方法是在這些酶的反應(yīng)體系中，先加入緩沖液，再加入酸性化合物試劑，然后加入酶或者抑制劑，再還原后得到的有顏色的化合物，用比色法檢測(cè)其產(chǎn)生顏色化合物的濃度，從而用于測(cè)算法呢基焦磷酸合酶等類酶的活性動(dòng)力學(xué)及其用于酶的抑制劑藥物篩選。這個(gè)方法沒有本底吸收，而反應(yīng)后的吸收峰很強(qiáng)，說明這個(gè)方法精度和靈敏度高，外界因素干擾少。此方法具體操作過程見圖1，反應(yīng)后吸收的圖譜見圖2。

本發(fā)明的活性測(cè)定試劑盒包括緩沖液、穩(wěn)定劑、酸性化合物試劑、還原劑。其中酸性化合物試劑指的是：鎢酸鈉鹽或者銨鹽，鉬酸鈉鹽或者銨鹽，砷酸鈉鹽或者銨鹽等之一或其組合。還原所用的試劑指的是：孔雀綠，羅丹明，甲基紫，結(jié)晶紫，抗壞血酸，巰基乙醇，二硫蘇糖醇，亞硫酸鈉，焦亞硫酸鈉，硫酸鐵，二氯化錫，硫酸亞鐵銨，果糖等之一或其組合。

試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解使用，或者配置液體試劑，直接使用，本發(fā)明的試劑盒低溫長(zhǎng)期存放穩(wěn)定，重復(fù)性好，在酶的和底物的用量很少的條件下，可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定。

該方法適用的酶主要是法呢基焦磷酸合酶(FPPS)，牻牛兒牻牛兒焦磷酸合酶(GGPPS)，角鯊烯合成酶(SQS)，法尼基轉(zhuǎn)移酶(FTase)，牻牛兒牻牛兒轉(zhuǎn)移酶(GGTase)，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MDD，以及其他涉及以磷酸或焦磷酸為產(chǎn)物或底物的酶或蛋白。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例一：

在法呢基焦磷酸合酶(FPPS)反應(yīng)體系中，加入抑制劑條件下，混合10分鐘后，加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)算出法呢基焦磷酸合酶的活性。

實(shí)施例二：

把法呢基焦磷酸合酶(FPPS)，反應(yīng)底物，緩沖液，穩(wěn)定劑，加入96板孔中，加入不同濃度的抑制劑，混合10分鐘后，加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)算出系列的法呢基焦磷酸合酶的活性。

實(shí)施例三：