[發(fā)明專利]一種斑點叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的高效表達技術(shù)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310131113.0
• 申請日: 2013-04-16
• 公開（公告）號: CN103275985A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陶妍;趙冬梅
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 上海卓陽知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262
• 代理人: 曹翠娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域重組蛋白質(zhì)的表達和純化技術(shù)，具體地說，是一種斑點叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的高效表達技術(shù)。

背景技術(shù)

????抗菌肽是由生物細胞特定基因編碼的一類具有強抗菌作用的小分子多肽，其抗菌譜廣、無耐藥誘導(dǎo)性、分子量小而耐熱性好，且具免疫調(diào)節(jié)功能，在機體天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮了重要作用，被認為是飼用抗生素替代品的最佳候選者，因此，極具開發(fā)應(yīng)用前景。

hepcidin抗菌肽的特點是分子量小、富含半胱氨酸、帶正電荷，屬于β-防御素家族，其分子內(nèi)由4對二硫鍵形成的β-環(huán)狀結(jié)構(gòu)與抗菌功能有關(guān)；由于它兼具廣譜抗菌和對鐵代謝的負調(diào)控作用而越來越受到關(guān)注。hepcidin最初是從人的血漿和尿液中分離獲得，其成熟肽被確定由25個氨基酸殘基組成。隨后，有其他哺乳動物和一些魚類如虹鱒、斑馬魚、鮰魚和羅非魚的關(guān)于hepcidin的研究報道，但大多數(shù)僅局限于從生物中提取或?qū)ζ渚幋a基因的克隆方面。即便是做原核或真核的重組DNA表達，因為考慮到密碼子的偏愛性，大多數(shù)也是使用合成的DNA，而非克隆的天然抗菌肽基因，且表達量都很低。

魚類抗菌肽是魚類先天免疫的重要組成部分，使用抗菌肽作為綠色飼料添加劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的疾病防治，具有廣闊的應(yīng)用前景。中國專利文獻CN201010505548.3，公開日2011年2月16日，公開了一種大黃魚hepcidin抗菌肽及其制備方法。該hepcidin抗菌肽的制備步驟包括：克隆大黃魚hepcidin抗菌肽基因，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞，挑選陽性克隆進行原核表達，分離純化表達產(chǎn)物，獲得大黃魚hepcidin抗菌肽，解決了大黃魚hepcidin抗菌肽表達復(fù)性時會有蛋白析出的問題。但是關(guān)于本發(fā)明斑點叉尾鮰（英文名Catfish，學(xué)名Ictalurus?punctatus）hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的高效表達技術(shù)，還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種采用原核表達系統(tǒng)高效表達具有生物學(xué)活性的斑點叉尾鮰hepcidin成熟肽的基因工程技術(shù)，即斑點叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的高效表達技術(shù)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種斑點叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的高效表達技術(shù)，包括以下步驟：

（1）通過RT-PCR獲得來自斑點叉尾鮰肝臟的編碼hepcidin成熟肽的天然cDNA片段，構(gòu)建融合表達載體pET32a-mCH，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的重組融合蛋白TrxA-mCH經(jīng)Ni-IDA親和層析，得到純化；

（2）采用腸激酶對純化的融合蛋白TrxA-mCH進行處理，以除去融合頭，同時通過添加尿素，使目的肽得到正確的折疊；

（3）通過分子篩層析對酶切混合液進行分離，得到純化的目的肽產(chǎn)品mCH。

步驟（1）中所述的IPTG誘導(dǎo)表達的溫度為30℃。

步驟（2）中所述的腸激酶處理的反應(yīng)體系為：經(jīng)Ni-IDA親和層析純化的融合蛋白TrxA-mCH、腸激酶、25mmol/L?Tris-HCl、50mmol/L?NaCl、2mmol/L?CaCl₂、1mmol/L二硫蘇糖醇、終濃度為1mmol/L的尿素；反應(yīng)溫度為25℃，反應(yīng)時間為16h；腸激酶的用量為每50μg融合蛋白一個酶活單位。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明方法采用了通過PCR獲得的編碼斑點叉尾鮰hepcidin成熟肽的天然cDNA，在原核表達時采用了相對較高的30℃作為表達溫度，表達效果好；

2、由于目的肽含有8個半胱氨酸殘基，很容易形成分子間的二硫鍵，因此，在對融合蛋白進行腸激酶處理時，添加適量濃度的二硫蘇糖醇（DTT），以防止分子之間的聚合；同時添加了尿素，使目的肽在融合蛋白狀態(tài)下得到正確折疊，避免了通常采用的復(fù)雜復(fù)性步驟；

3、本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)在原核細胞中高效表達了斑點叉尾鮰hepcidin的成熟肽mCH，產(chǎn)品經(jīng)抗菌活性測定，對革蘭氏陽性和陰性細菌具有明顯的抑菌效果，對于綠色飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用來說具有重要的實際應(yīng)用價值。

附圖說明

附圖1是重組融合表達載體的構(gòu)建圖。