[發(fā)明專利]一種G因子的分離純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310107664.3
• 申請日: 2013-03-30
• 公開（公告）號: CN103214566A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設計）人: 丁友玲
• 申請（專利權）人: 福州新北生化工業(yè)有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及鱟試劑的技術領域，特別是一種G因子的分離純化方法。

背景技術

1968年Levin?J和Bang?F?B創(chuàng)建鱟試劑以來，使內毒素的檢測成為靈敏、快速、簡便的方法，已被舉世公認，并被美、日、中、歐洲藥典以《細菌內毒素試驗》收載。但1981年日本學者Kakinuma?A發(fā)現非熱原物質（1-3）-β-D-葡聚糖也可使鱟試劑凝聚，這極大影響了普通鱟試劑檢測內毒素的特異性，因而目前檢測內毒素的鱟試劑主要為特異鱟試劑，其生產工藝的特點是利用親和層析方法將普通鱟試劑中存在的可以和（1-3）-β-D-葡聚糖產生凝聚反應的G因子分離去除，如本發(fā)明人申請的中國專利CN1621841A中披露的“抗干擾鱟試劑的制備工藝”。

因為葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分，而患者的真菌感染檢測在醫(yī)學上一直是個難題，所以葡聚糖與G因子發(fā)生凝聚反應的原理很快被用于真菌感染的檢測上，如本發(fā)明人申請的中國專利CN101880706A披露的“一種直接真菌檢測鱟試劑盒及方法”。該檢測方法對G因子的純度要求較高，尤其是鱟血細胞中含有的凝固原（coagulogen）不能混雜其中，而常規(guī)親和層析法分離的G因子和凝固原是在同一區(qū)間洗脫的，因此G因子的合并組分中通常含有凝固原組分，并不能直接作為真菌檢測的試劑來使用。所以，要么以獲取高純度G因子組分為目標開發(fā)一種從鱟全血中特異性分離純化G因子的方法，要么以特異鱟試劑生產過程中產生的含有凝固原的G因子合并組分為基礎發(fā)明進一步分離純化的方法。顯然，后一種方法更能夠充分利用寶貴的鱟資源，但是從G因子組分中去除性質相近的凝固原是一個技術難題。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種G因子的分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細胞步驟及將血細胞崩解后利用親和層析法對鱟血細胞中包括G因子的各種血細胞成分進行初級分離純化的步驟，其還包括對初級分離純化所得的主要含G因子的合并組分進一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分。

該進一步分離純化的步驟為：

第一步：制備ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱，該ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱規(guī)格為柱為Ф2×16cm，用含有pH=8.0、0.25?mol/L?NaCl的20?mM?Tris-HCl?溶液進行預平衡，接著以上述主要含G因子的合并組分作為樣品上樣；

第二步：用0.5?mol/L?NaCl溶液充分沖洗及0.5?mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液洗脫，該0.5?mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液用pH=8.0、20?mM?Tris-HCl?溶液配制；

第三步：收集第二步產生的洗脫液，用Amicon?PM-10超濾膜濃縮；

第四步：收集第三步產生的濃縮液，用Sephacryl?S-200HR柱進一步提純，該Sephacryl?S-200HR柱為Ф2.7×98cm，用pH8.0、50mM?Na₃PO₄緩沖液預平衡；

第五步：收集第四步產生的高純度G因子合并組分，用冷凍干燥機低溫濃縮。

本發(fā)明的技術方案實現了對鱟資源的充分利用，同時克服了凝固原難以從G因子組分中除去的難題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線。

圖2為本發(fā)明的Sephacryl?S-200HR柱洗脫曲線。

具體實施方式

本發(fā)明揭示一種G因子分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細胞步驟及將血細胞崩解后利用親和層析法對鱟血細胞中包括G因子的各種血細胞成分進行初級分離純化的步驟，還包括對初級分離純化所得的主要含G因子的合并組分進一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分。

如中國專利申請CN1632580A中的具體實施方式部分披露的，典型的從鱟全血中分離提取血細胞步驟及將血細胞崩解后利用親和層析法對鱟血細胞中包括G因子的各種血細胞成分進行初級分離純化的步驟為：