[發明專利]一種動物細胞培養用膠原蛋白覆層微載體及其制備方法

有效

• 申請號: 201310099817.4
• 申請日: 2013-03-26
• 公開（公告）號: CN103215217A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 馬光輝;周煒清;康躋耀;張貴峰;蘇志國;孫李靖;李娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N5/02
• 分類號: C12N5/02;C08J9/36;C12N5/07
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

技術領域

本方法涉及一種動物細胞培養用微載體及其制備方法，尤其涉及一種動物細胞培養用膠原蛋白覆層微載體及其制備方法，屬于生化工程領域。

背景技術

微載體是細胞培養中所使用的一類無毒性、非剛性、密度均一、通常是透明的小顆粒，能使依賴貼壁的細胞在懸浮培養時貼附在顆粒表面單層生長，從而增加細胞貼附生長的面積，有利于細胞的大規模培養和收集。微載體培養是目前用于動物細胞大規模培養的主要技術。利用微載體系統進行貼壁依賴型動物細胞的大規模培養是國內外生物醫藥企業采用的主要生產方式，用于各類細胞及細胞產品包括疫苗、抗體等生物藥的生產。

自1967年Van?Wezel首次成功應用微載體培養動物細胞以來，微載體培養技術越來越受關注，目前已有多種微載體產品上市。法瑪西亞（Pharmacia）公司開發的Cytodex1、Cytodex2和Cytodex3系列商品是目前應用最為廣泛的幾種微載體。此外，進行表面修飾后的聚苯乙烯、瓊脂糖、纖維素、殼聚糖等十多種微球也被用來作為微載體，并已商品化。另外，還有兩種及以上混合材料制備的微載體，如絲素蛋白和殼聚糖大孔微載體(CN101624472A)，殼聚糖和明膠混合微載體(CN1321175C)。

在眾多的微載體產品中，膠原蛋白覆層微載體近年來備受重視。這種微載體特別適用于某些難以生長的細胞、分化細胞培養系統、尤其是具有上皮樣形態學特征細胞的培養。膠原蛋白覆層微載體的另一個優勢在于變性膠原蛋白層可以在溫和條件下很容易地被胰蛋白酶或膠原蛋白酶等多種蛋白酶消化，能在維持細胞最大活性、功能和完整性的同時將細胞從微載體上分離出來，這對組織過程等領域的需要至關重要。

膠原蛋白覆層微球作為微載體主要有以下制備技術。Hillegas等公開了一種膠原蛋白覆層聚苯乙烯微球(Hillegas?R,William?J,Arbor?A.Collagen-coated?Polystyrene?Microcarier?Beads[P].US4994388.)，在聚苯乙烯微球表面覆層層粘連蛋白或纖連蛋白，再置于含膠原蛋白蛋白的醋酸溶液中升溫蒸發，制備了一種膠原蛋白覆層聚苯乙烯微球。Machiko?KATO等發明了一種膠原蛋白包被微載體的制備方法(Machiko?KATO,Saitama.Ken?SUGO,Saitama.Collagen-coated?carrier?and?method?for?manufacturing?collagen-coated?carrier[P].US20060270037A1.)，其以磷酸鈣鹽化合物為基質，通過纖維連接蛋白或整合素為連接臂，將膠原蛋白蛋白連接到微球表面。但纖維連接蛋白所需的操作條件較為苛刻且價格較為昂貴，不利于工業化生產。王國祥等研究了明膠包被的瓊脂糖微載體及其細胞培養特性(王國祥，聶峰光，蘇志國等，明膠包被的瓊脂糖微載體及其細胞培養特性[J]，藥物生物技術，2001，8(5)：P264-267。)，提供了一種以瓊脂糖為基質的膠原蛋白包被的微載體制備方法，這種方法是以阿拉伯膠與明膠所形成的聚電解質為原料來覆層，且覆層分子是以物理作用吸附于瓊脂糖微球上，蛋白的連接并不牢固，生物相容性和細胞培養效果并不理想。

另一種成熟的膠原蛋白覆層微載體是Cytodex3。這種微載體覆層膠原蛋白選用的是Ⅰ型豬皮變性膠原蛋白，膠原蛋白的分子量為60,000-200,000，覆層量約為微球質量的16.2%，粒徑為133-215μm。微載體的基質為葡聚糖微球，膠原蛋白通過環氧氯丙烷共價交聯在葡聚糖微球表面。目前這種微載體已在多種細胞的培養中獲得良好效果。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種動物細胞培養用膠原蛋白覆層微載體。本發明所提供的微載體表面蛋白覆蓋均勻，連接牢固，利于細胞的快速貼附和高密度生長，能夠在低的膠原蛋白覆層量下實現較Cytodex3相當甚至更優的細胞培養效果；且制成的微載體成本低廉，周期較短，有利于工業化生產。

本發明所提供的動物細胞培養用膠原蛋白覆層的微載體，所述微載體的基質為魔芋葡甘聚糖微球，膠原蛋白的覆層量為基質微球質量的1%-10%，如2%、3.5%、4%、5%、6.5%、7%、8.5%等，覆層的膠原蛋白通過活化試劑與基質微球共價偶聯。

魔芋葡甘聚糖（KGM）微球具有良好的親水性和生物相容性，對細胞沒有毒性，覆層后仍為透明狀，利于用顯微鏡直接觀察細胞培養狀態。基質微球具有孔道，使營養物質能夠到達細胞與基底接觸的部位，有利于細胞生長。