[發(fā)明專利]一種超聲輔助熒光染色檢測(cè)微藻油脂含量的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310097321.3
• 申請(qǐng)日: 2013-03-25
• 公開（公告）號(hào): CN103163113A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉冰峰;任宏宇;任南琪;謝國(guó)俊;趙磊;馬超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N1/30
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 高會(huì)會(huì)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法。

背景技術(shù)

生物柴油是新型“綠色能源”，具有可再生和環(huán)境保護(hù)的雙重功效，符合國(guó)家“十二五”規(guī)劃節(jié)能減排和低碳經(jīng)濟(jì)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。目前，生物柴油主要以動(dòng)植物油脂（豬油、牛油、玉米、大豆、油菜籽等農(nóng)作物）以及餐飲廢油為主要生產(chǎn)原料，是替代傳統(tǒng)石化能源、減少溫室氣體排放的新型可再生能源。然而傳統(tǒng)的以農(nóng)作物為原料生物柴油生產(chǎn)技術(shù)，對(duì)農(nóng)作物需求量大，從而形成了“與人爭(zhēng)糧，與糧爭(zhēng)地”的局面，導(dǎo)致糧食價(jià)格上漲。因此，積極尋找新的生物質(zhì)能源材料，緩解面臨的糧食和能源危機(jī)、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展已成為世界各國(guó)決策者和研究者高度關(guān)注的問題。

在生物柴油制備的各種原材料中，微藻是重要的可再生資源，同時(shí)也是生物柴油巨大的資源庫(kù)，具有分布廣泛、光合效率高、生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量高、富含油脂、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，最重要的是不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，微藻的生長(zhǎng)能夠捕獲廢氣中的二氧化碳，既可以降低生物柴油生產(chǎn)成本又可以緩解溫室氣體效應(yīng)。因此，微藻生物柴油被認(rèn)為是唯一可能取代化石油的重要替代品，發(fā)展前景廣闊。

目前制約微藻生物柴油規(guī)模化的瓶頸問題是昂貴的生產(chǎn)成本，其根本也取決于微藻藻種的含油量。因此，培育出生長(zhǎng)迅速、環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、富油的微藻新品種是微藻生物柴油提高產(chǎn)率和降低成本的關(guān)鍵。然而用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法測(cè)定微藻油脂含量繁瑣、費(fèi)力、成本高、易造成環(huán)境污染，同時(shí)其檢測(cè)費(fèi)時(shí)（通常為3～4天），難以滿足富油微藻篩選大規(guī)模、快速、高效的要求。

尼羅紅是一種疏水性較強(qiáng)的熒光染料，可以根據(jù)極性的不同展現(xiàn)出從黃色到紅色的熒光顏色，但在水環(huán)境中尼羅紅所發(fā)的熒光會(huì)完全淬滅。此外，由于尼羅紅具有良好的光化學(xué)穩(wěn)定性和特殊的發(fā)光波長(zhǎng)范圍，故可排除多數(shù)生物分子在測(cè)定中的干擾。經(jīng)尼羅紅染色后微藻細(xì)胞所發(fā)的熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)的油脂含量顯著相關(guān)，并且尼羅紅染色法耗時(shí)較短、所需生物樣品量少、操作步驟較為簡(jiǎn)單，可直接用于測(cè)定微藻細(xì)胞的油脂含量，使分析測(cè)定方法明顯簡(jiǎn)化。

由于微藻的細(xì)胞壁厚且堅(jiān)硬，尼羅紅不易穿透細(xì)胞與油脂粒結(jié)合，導(dǎo)致染色效果不理想，因此，采用有效的破壁方法以提高尼羅紅的染色效果是實(shí)現(xiàn)快速、高效油脂檢測(cè)方法的關(guān)鍵。

超聲波振動(dòng)時(shí)能發(fā)出并傳遞強(qiáng)大的能量，可以對(duì)媒質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)、空化、攪拌等作用。且其具有高效、能耗低、保持胞內(nèi)物質(zhì)生物活性等特點(diǎn)。通過超聲波能高效的破壞細(xì)胞壁，使其中的成分溶于溶劑中，更有助于熒光染料的染色。然而，尚缺乏超聲波應(yīng)用于微藻熒光染色方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有檢測(cè)微藻油脂含量的方法繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、易造成環(huán)境污染以及尼羅紅對(duì)微藻細(xì)胞染色效果不理想的問題，而提供了一種超聲輔助熒光染色檢測(cè)微藻油脂含量的方法。

本發(fā)明的一種超聲輔助熒光染色檢測(cè)微藻油脂含量的方法，是由下列步驟實(shí)現(xiàn)的：

一、取微藻藻液，經(jīng)離心收集固相物，加入等體積的去離子水或超純水，得重懸微藻細(xì)胞，將其分成兩份待用；

二、將步驟一得到的一份重懸微藻細(xì)胞，在溫度為0～4℃的條件下超聲破碎1～30min；

三、向步驟二超聲破碎后的重懸微藻細(xì)胞中加入尼羅紅混勻，避光染色1～30min，將染色后的微藻細(xì)胞分為兩份；

四、取步驟三中的一份染色后的微藻細(xì)胞，采用三維熒光光譜對(duì)步驟三染色后的微藻細(xì)胞測(cè)定熒光強(qiáng)度；

五、取步驟三中另一份的染色后的微藻細(xì)胞，采用二維熒光光譜測(cè)定熒光強(qiáng)度，將染色后的微藻細(xì)胞二維熒光光譜所測(cè)定的熒光強(qiáng)度數(shù)值減去尼羅紅和未進(jìn)行尼羅紅染色微藻細(xì)胞在二維熒光光譜相同波長(zhǎng)下測(cè)得的熒光強(qiáng)度數(shù)值之和，即得相對(duì)熒光強(qiáng)度，然后取步驟一中的另一份重懸微藻細(xì)胞采用有機(jī)溶劑提取法測(cè)定油脂含量，構(gòu)建相對(duì)熒光強(qiáng)度-油脂含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

六、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算待測(cè)微藻的油脂含量；

標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y=0.0268x-1.5532；其中，R²=0.9957，y為油脂含量，單位為mgL^-1；x為相對(duì)熒光強(qiáng)度；

其中，步驟三中所述的尼羅紅加入量為加入尼羅紅至溶液中尼羅紅的濃度為0.1～5.0mgL^-1；步驟四中所述的三維熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)為220～750nm，發(fā)射波長(zhǎng)為220～750nm；步驟五中所述的二維熒光光譜的激發(fā)波長(zhǎng)為450～550nm，發(fā)射波長(zhǎng)為500～700nm。

本發(fā)明包含以下有益效果：