[發明專利]一種絲氨酸蛋白酶編碼基因和重組酶及應用

無效

• 申請號: 201310085174.8
• 申請日: 2013-03-15
• 公開（公告）號: CN103160527A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 侯進慧
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/52;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 周愛芳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種絲氨酸蛋白酶編碼基因和重組酶及應用。

背景技術

絲氨酸蛋白酶是一個蛋白酶家族，其主要作用是斷裂大分子蛋白質中的肽鍵。核心結構由N結構域和C結構域構成。絲氨酸蛋白酶的催化位點和重要功能位點存在于這兩個結構域間。絲氨酸蛋白酶的功能具有特異性和復雜性，所催化的底物特異性強。蛋白質在功能進化的過程中不僅要適應物種進化的外在環境，同時也要適應內在分化所產生的體內環境。在這過程中，絲氨酸蛋白酶也為適應一些新功能而產生了分化。目前，一些絲氨酸蛋白酶的結構已經被測定，其催化機制、活性部位也有研究。相關研究為利用蛋白質工程改造絲氨酸蛋白酶的研究提供了基礎。有研究人員通過改變活性部位殘基研究對催化性能的影響，比如Asp102被Asn取代，驗證了Asp102在催化機制中的作用；

在哺乳動物體內，絲氨酸蛋白酶在消化、凝血和補體系統方面發揮著重要作用。絲氨酸蛋白酶在心血管疾病醫治方面有廣泛的應用；最近發現的一種分布于心臟的特異性II型跨膜絲氨酸蛋白酶，能將A型利鈉肽前體(pro?ANP)和B型利鈉肽前體(pro-BNP)轉化為ANP和BNP。研究發現，植物細胞中的絲氨酸蛋白酶在植物器官衰老過程中發揮著作用，多種植物的葉和花的衰老過程都與絲氨酸蛋白酶基因表達相關聯；真菌基礎上的絲氨酸蛋白酶研究也有應用，通過芯片技術結合免疫組化方法，不僅能夠檢測多種新生隱球菌菌株細胞中絲氨酸蛋白酶的表達分布，還可以橫向對比絲氨酸蛋白酶在新生隱球菌致病過程中的作用。

新型絲氨酸蛋白酶的研究與開發是獲得特異性絲氨酸蛋白酶的基礎。目前對細菌中新型絲氨酸蛋白酶的開發較少，在Pantoea?ananatis中的研究未有報道。隨著分子生物學、基因工程的迅猛發展，研究人員開始應用基因工程技術構建新型絲氨酸蛋白酶降解菌株、開發新型絲氨酸蛋白酶，這將促進新型絲氨酸蛋白酶產品的開發與應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新型絲氨酸蛋白酶編碼基因ds的基因序列及其氨基酸序列。采用PCR方法克隆獲得絲氨酸蛋白酶編碼基因。

本發明的一種新型絲氨酸蛋白酶編碼基因ds，所述絲氨酸蛋白酶的基因序列為SEQ?ID?NO.1。

所述絲氨酸蛋白酶的基因ds是一個完整的開放閱讀框（ORF），該開放閱讀框以啟始密碼子ATG開始，以終止密碼子TGA結束，共包括1062bp。

本發明的一種新型絲氨酸蛋白酶，所述絲氨酸蛋白酶的重組酶氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2。

所述內切絲氨酸蛋白酶共352個氨基酸序列。

本發明的另一目的，在于提供一種新型重組絲氨酸蛋白酶DS。該重組酶的蛋白酶活性高，達到22.17U/mL。

所述重組絲氨酸蛋白酶DS的制備方法，包括如下步驟：

（1）重組菌株的構建：

以F:GAGCATATGTTTCTTAAACTCTTGCGT和R:ATCTCGAGCTACTGACTGCTGTCC為PCR反應的引物；以PCR方法從菌株Pantoea?ananatis?P5（CGMCC?NO.5356）基因組中克隆獲得絲氨酸蛋白酶編碼基因ds全長，以兩種限制性內酶NdeI和XhoI將基因ds進行雙酶切，并連接到原核表達載體pET中，構建成質粒pETDS，轉化E.coli?BL21感受態細胞，利用NdeI和XhoI雙酶切，篩選獲得重組菌株，構建成重組絲氨酸蛋白酶DS的表達菌株DS/BL21(DE3)；

（2）重組菌株的培養和重組絲氨酸蛋白酶的獲得：

將重組菌株DS/BL21(DE3)接種到50mL?LB（含30μg/mL卡那霉素）液體培養基中，在37℃震蕩培養；待OD₆₀₀為0.5時，加入0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導4h終止培養；將培養液在液氮中速凍，放冰水混合物里融化，使用超聲波破碎細胞，10000r/min離心5min，取上清即為重組內切絲氨酸蛋白酶的酶液。

本發明的再一目的，在于提供上述新型重組絲氨酸蛋白酶DS的應用。所述絲氨酸蛋白酶能夠應用于蛋白質的降解。

本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果：

（1）根據酶基因序列BLAST分析結果結合酶的分子量、等電點和酶學特性等特性與已知蛋白的差異判斷，該重組絲氨酸蛋白酶DS的基因是一種新型絲氨酸蛋白酶基因。這是首次從Pantoea?ananatis菌株中開發出重組絲氨酸蛋白酶基因。