[發明專利]誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法

在審

• 申請號: 201310081154.3
• 申請日: 2013-03-14
• 公開（公告）號: CN103146645A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 趙文卓;王涵;劉韜
• 申請（專利權）人: 深圳市博泰生物醫學科技發展有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于干細胞技術領域，具體涉及一種誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法。

背景技術

目前修復軟骨組織的傳統方法是采用自體軟骨細胞，此法必須在關節鏡下切取非負重區的關節軟骨，對其中的軟骨細胞進行擴增，這種手術唯一的優點為無抗原性，但造成機體損傷很大。另外軟骨組織中絕大部分為基質，軟骨細胞數量少且難分離，體外傳代次數有限，一般最多培養3～4代，所以難以獲得大量細胞。

當前，骨髓間充質干細胞誘導成軟骨細胞普遍采取高密度聚團誘導。該方法一般將擴增后的細胞離心成細胞團，再用成軟骨細胞誘導培養基進行微團誘導。但是成軟骨細胞誘導需要大量的骨髓間充質干細胞，為了獲得大量的骨髓間充質干細胞，必須在體外進行長時間的傳代培養，而隨著細胞培養時間的延長，干細胞的多向分化潛能會出現程序性丟失，消化過程中使用的胰酶也會導致細胞活性的降低。

間充質干細胞（MSCs）是成體干細胞的一種，它具有多向分化潛能，為類風濕性關節炎，骨關節炎及先天性軟骨發育不良等疾病的細胞治療開辟了一條新的途徑。并且最新研究表明，MSCs可以作用于抑制患者自身的炎癥反應，以及緩解一些退行性疾病的癥狀。

目前采用MSCs分化成軟骨細胞的方法一般是將MSCs培養至傳代的MSCs后，再在含有定向誘導為軟骨細胞的因子的培養基中進行誘導培養，將MSCs誘導成軟骨細胞。但是由于MSCs的定向誘導分化受很多不同信號通路的影響，而且誘導培養MSCs的細胞微環境變化對于MSCs誘導分化及其分子結構有著非常重要的影響。因此。導致現有的MSCs分化成軟骨細胞的方法所需周期都較長，通常需要2-4周，并且誘導后II型膠原的表達效率較低。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種誘導時間短、誘導后II型膠原的表達效率高的誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法。

為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：

一種誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，包括如下步驟：

獲取間充質干細胞和軟骨細胞；

將所述軟骨細胞接種于軟骨細胞培養液中進行培養；

將所述間充質干細胞接種于插入式細胞培養皿中，再將接種有所述間充質干細胞的所述插入式細胞培養皿置于所述軟骨細胞培養液中，并將所述軟骨細胞培養液更換成軟骨細胞誘導分化培養基后進行共同培養；其中，所述軟骨細胞誘導分化培養基中含有2×10^-7～5×10^-7mol/L的甲狀旁腺激素相關蛋白1-34。

上述誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法采用插入式培養皿共同培養軟骨細胞和間充質干細胞，使兩種細胞可以模擬體內環境而發生協同作用，利用誘導MSCs分化成軟骨細胞因子與軟骨細胞分泌的細胞外基質作誘導因子的協同作用，從而顯著的縮短了誘導MSCs分化成軟骨細胞的時間，提高了軟骨細胞增殖率，并且同時提高了誘導分化后細胞的II型膠原的表達率與表達量，誘導分化后細胞的糖胺聚糖（GAG）的分泌也得到了明顯提高。另外，MSCs與軟骨細胞通過插入式培養皿而分隔開生長，有效的避免兩細胞間的交叉污染，保證兩細胞的純度，從而利用MSCs的誘導和軟骨細胞的增值。

附圖說明

圖1是本發明實施例誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法工藝流程示意圖；

圖2是本發明實施例1的步驟S11中分離培養的MSCs的流式檢測結果分析圖；其中，圖2A為傳代培MSCs的CD29、CD34、CD44和CD45表達率柱狀圖，圖2B為MSCs的CD29表達率圖，圖2C為MSCs的CD34表達率圖，圖2D為MSCs的CD44表達率圖，圖2E為MSCs的CD45表達率圖；

圖3是本發明實施例1與對比實例1中MSCs誘導分化為軟骨細胞中的陽性表達II型膠原細胞的流式檢測圖；其中，圖3A為實施例1與對比實例1分別誘導第5和第8天時，MSCs誘導分化為軟骨細胞中陽性表達II型膠原的細胞所占比率的柱狀圖；圖3B為實施例1中的MSCs誘導5天時，陽性表達II型膠原細胞表達率圖；圖3C為對比實例1中的MSCs誘導5天時，陽性表達II型膠原細胞表達率圖；圖3D為實施例1中的MSCs誘導8天時，陽性表達II型膠原細胞表達率圖;圖3E為對比實例1中的MSCs誘導8天時，陽性表達II型膠原細胞表達率圖；

圖4是本發明實施例1、對比實例1中的MSCs分別誘導5天和8天后以及對比實例2中的MSCs中的陽性表達II型膠原的細胞的熒光表達測定結果圖；