[發明專利]一種營養繁殖花卉水仙超低溫保存及植株再生方法

無效

• 申請號: 201310076087.6
• 申請日: 2013-03-11
• 公開（公告）號: CN103141473A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 林田;楊華;龍萍;朱天生;劉灶長;李天菲;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: A01N3/02
• 分類號: A01N3/02;A01H4/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 何新平

技術領域

本發明涉及到一種植物種質資源的保存及植株再生方法，，尤其涉及到一種營養繁殖花卉的超低溫保存及植株再生方法，具體的說是涉及到一種崇明水仙的超低溫保存及植株再生方法,屬植物細胞工程技術領域。

背景技術

崇明水仙（Narcissus?tazetta?var.?chinensis）是上海市特色花卉品種之一，早在明朝就有栽培。它花香優雅、花期長，株型矮小，園林上適合配植在草地邊緣或布置花壇、花境，具有廣泛應用前景，近年來已銷售國際市場。在常規生產及保存過程中，由于病毒病嚴重及種源退化，嚴重阻礙了崇明水仙的產業化發展：因崇明水仙為同源三倍體，具高度不孕性，無法通過種子保存資源。通常采用鱗莖在圃地保存的方式，并通過分離小籽球的方法進行繁殖，１個種球1年僅能繁殖?3～4?個籽球，年繁殖系數低。此外，我國水仙病毒病危害非常嚴重，作為種源用的鱗莖在長年持續栽培下，病毒積累日益嚴重，造成產量逐年萎縮，種性退化，失去觀賞價值和商品性。通過組織培養保存除了需定期繼代，需要大量人力及物力外，還有污染及品種退化的危險。因此，建立一套經濟高效的崇明水仙種質保存體系，探索快速、有效、穩定的崇明水仙離體脫毒方法，對有效保護崇明水仙種質資源,提純復壯、加速產業化進程具有現實意義。

超低溫保存是指在液氮（-196℃）下的低溫保存。在此條件下，植物的生物化學活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內，被認為是植物遺傳資源長期保存的最優選擇。它避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質變異或毀滅，以及組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。關于植物超低溫保存的研究，在進入到20世紀90年代后，保存技術的多樣化與簡易化方面不斷取得進步，能夠保存的植物物種數也在不斷地增長，但多數集中在蘋果、櫻桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及馬鈴薯、紅薯、草莓等薯類植物為主的植物遺傳資源的超低溫保存。在超低溫保存技術方面，崇明水仙屬球宿根植物，目前對此類植物中百合及大蒜的相關報導較多，水仙同科（石蒜科）植物中，上海市農業生物基因中心（申報單位）已對紅花石蒜成功進行超低溫保存并申請相關專利（中國：CN1934941:?2007）。

發明內容

本發明的目的是提供一種營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生方法。

為了實現上述的目的，本發明采用的技術方案是提供一種營養繁殖花卉的超低溫保存及植株再生的方法，所述超低溫保存方法包含以下步驟：將營養繁殖花卉的鱗莖進行誘導，切取大小2~5mm的莖尖，將所述帶有根原基和芽原基的莖尖進行預培養，然后置于預處理溶液中在室溫下處理15～30min，將預處理溶液中處理過的莖尖轉入玻璃化保護劑中進行冰浴處理60～120min，將冰浴處理的莖尖轉移至裝有預冷過的新鮮玻璃化保護劑的冷凍管中，然后將冷凍管迅速投入到液氮中保存。

本發明采用的優選實施方案是，所述的營養繁殖花卉為崇明水仙。

本發明采用的優選實施方案是，所述誘導包含的步驟有：選取3～4年生崇明水仙鱗莖；將崇明水仙的鱗莖用70%酒精消毒1?min，0.1%的升汞消毒10~20min，然后用無菌水沖洗；將沖洗過的鱗莖切塊接種于含1?mg·L^-1?BA及1?mg·L^-1?NAA的MS培養基上誘導出小鱗莖。

本發明采用的優選實施方案是，所述MS培養基上誘導的培養溫度為23～27℃,?光照12?h·d^-1，光照強度36?μmol?m^-2?s^-1，繼代為3個月。

本發明采用的優選實施方案是，所述預培養是指將誘導后的莖尖接種到含0.3~0.5?mol·L^-1蔗糖的MS培養基內在25℃下培養1~5天。

本發明采用的優選實施方案是，所述預處理溶液為2?mol·L^-1甘油和0.4?mol·L^-1蔗糖的MS液體培養基。

本發明采用的優選實施方案是，所述玻璃化保護劑為3.26?mol·L^-1甘油、?2.42?mol·L^-1乙二醇、1.9?mol·L^-1?DMSO和0.4?mol·L^-1蔗糖。