[發(fā)明專利]一種具有啟動(dòng)苜蓿質(zhì)體藍(lán)素特異表達(dá)的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子及一對快速克隆該啟動(dòng)子的引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310073530.4
• 申請日: 2013-03-08
• 公開（公告）號: CN103131712A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇昕;游松;薛柏忠;王彩云;劉鑫;禚瑞芳
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽藥科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽杰克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 李宇彤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有啟動(dòng)苜蓿質(zhì)體藍(lán)素特異表達(dá)的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列及一對快速克隆該啟動(dòng)子的引物。

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背景技術(shù)

利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器，將外源基因?qū)胫参镏斜磉_(dá)外源重組蛋白，生產(chǎn)藥用蛋白或疫苗成為轉(zhuǎn)基因植物研究的熱點(diǎn)。但是外源基因在受體植物表達(dá)過程中，往往會(huì)出現(xiàn)表達(dá)效率低、表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定、甚至基因失活或沉默等不良現(xiàn)象，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物無法投入實(shí)際應(yīng)用。因此，常常需要構(gòu)建一種能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。為了更好的增加外源基因的表達(dá)活性，植物表達(dá)載體中的啟動(dòng)子起關(guān)鍵作用，其對外源基因的表達(dá)水平影響很大，是植物基因工程表達(dá)載體的重要元件。在雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中多使用花椰菜花葉病毒(CaMV)?35S啟動(dòng)子，在這種組成型啟動(dòng)子的控制下，外源基因在植物的所有部位和每個(gè)發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)，往往會(huì)引起植物的變異，影響植物的正常生長發(fā)育。而對于植物特異誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)表達(dá)的時(shí)空秩序特異性或外源誘導(dǎo)因子特異性，一方面能提高外源基因的表達(dá)效能及水平；另一方面可以節(jié)省生物能耗，減少外源基因?qū)χ参锉旧淼挠绊憽?/p>

目前植物啟動(dòng)子常用的克隆方法有：利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子、利用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子、環(huán)狀PCR、利用接頭連接介導(dǎo)的PCR散步法、TAIL-PCR。近年來人們大多采用PCR方法克隆植物基因啟動(dòng)子。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的基因序列設(shè)計(jì)引物，克隆所需基因的啟動(dòng)子。該方法簡便、快捷、操作簡單。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明的目的在于提供一種具有啟動(dòng)苜蓿質(zhì)體藍(lán)素特異表達(dá)的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列及一對快速克隆該啟動(dòng)子的引物。此苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子具有TATAbox、CAATbox等啟動(dòng)子必需元件、與光應(yīng)答有關(guān)的特異元件G-box?(ctttatca)及與組織特異性表達(dá)有關(guān)的GT1基序(aatccaca)等9個(gè)特異元件；并已通過試驗(yàn)驗(yàn)證此啟動(dòng)子具有一定光誘導(dǎo)特異性及葉片組織特異性，可驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS在轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片中特異表達(dá)。該引物是參照蒺藜苜蓿基因組相關(guān)序列而設(shè)計(jì)的特異性引物適用于采用PCR方法快速克隆苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

本發(fā)明的啟動(dòng)子具有如圖1所示的序列：

該啟動(dòng)子序列包括苜蓿質(zhì)體藍(lán)素編碼基因起始密碼子ATG上游共719bp。在起始密碼子ATG上游大約-97bp和-118bp位置有TATA-box和CAAT-box，其參與決定轉(zhuǎn)錄的方向，指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上，使其在正確的位置開始轉(zhuǎn)錄，是大部分植物啟動(dòng)子正確轉(zhuǎn)錄必須的；在啟動(dòng)子上游部分還包含了9個(gè)與光誘導(dǎo)有關(guān)的調(diào)控元件。LAMP-element?是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子的保守序列，也是光誘導(dǎo)啟動(dòng)子的標(biāo)志性序保列，并且位置通常臨近于TATA-box上游。?GT1-motif?則是一種組織特異性啟動(dòng)子的守序列，其控制基因在植物的葉片中表達(dá)，這個(gè)元件也與光誘導(dǎo)表達(dá)有一定的關(guān)系。Box?II?是GT-1蛋白的集合位點(diǎn)，其是在豌豆rbcS-3A?基因啟動(dòng)子中被發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為是一種光誘導(dǎo)表達(dá)元件。Pc-CMA2a，Pc-CMA2b，?Pc-CMA2c?這3個(gè)元件才、構(gòu)成了一個(gè)大的質(zhì)體藍(lán)素保守DNA排列（Pc-CMA）并且與光誘導(dǎo)調(diào)控相關(guān)。之后的G-box，ATCT-motif，GAG-motif，也都通過文獻(xiàn)報(bào)道確定其為與光誘導(dǎo)有關(guān)的調(diào)控元件。?

本發(fā)明的啟動(dòng)子通過如下方法得到：

（1）PCR法克隆啟動(dòng)子序列；包括a)反應(yīng)體系；b)反應(yīng)條件；c)雙向引物；其特征是：a)滅菌去離子水33.75ul，苜蓿基因組DNA5ul，10×PCRbuffer5ul，dNTPmix4ul，上、下游引物各1ul，rTaq0.25ul，b)預(yù)變性95℃2min，變性95℃30s，退火53℃30s，延伸72℃1min，循環(huán)30次，延伸72℃10min，c)上游引物5’-CCCAAGCTTAAAATAATAATGTGTGTTATGAGA-3’，下游引物5’-cgggatccgctctgacacaaagcctt-3’。

（2）瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物并送交基因公司測序并分析序列。