[發明專利]一種長薄鰍四堿基重復單元微衛星分子標記的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201310070294.0
• 申請日: 2013-03-06
• 公開（公告）號: CN103173442A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 劉紅艷;熊飛
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 劉麗君

技術領域

本發明屬于分子生物學DNA標記技術與應用領域，具體涉及一種長薄鰍四堿基重復單元微衛星分子標記的構建方法及其應用。

背景技術

長薄鰍為中國特有魚類，主要分布在長江中上游及其支流。長薄鰍是鰍科魚類中生長最快、個體最大的一種，其體色艷麗，肉味鮮美，是一種既可觀賞又可食用的名優經濟魚類，具有重要的開發價值。由于長江上游大型水水利工程的梯級開發，過度捕撈，環境污染等原因，長薄鰍資源量急劇的減少，已被列入《中國物種紅色名錄》。隨著長薄鰍種質保護和恢復、增殖放流及人工養殖工作的開展，分子生物學領域的研究工作也不斷的深入，準確的掌握長薄鰍的遺傳變異水平對其種群恢復和資源增值有著十分重要的意義。

微衛星標記（SSR,Simple?Sequence?Repeat）具有等位基因數目多、重復性好、呈共顯性等優點，開發微衛星分子標記，是構建分子遺傳圖譜、檢測遺傳多樣性、研究遺傳結構和基因流，進而實施分子輔助育種的有效工具。但現有的技術中，還沒有報道過長薄鰍四堿基重復單元微衛星分子標記。該技術在國內外均屬于空白。

發明內容

本發明的目的是提供一種條帶清晰、多態性高的，可以在長薄鰍中應用的四堿基重復單元的微衛星分子標記。

本發明所采用的技術方案是：

一種長薄鰍四堿基重復單元微衛星分子標記的構建方法，包括以下步驟：

（1）長薄鰍基因組DNA微衛星序列的獲得:

利用生物素四堿基重復探針和長薄鰍基因組酶切片段雜交，然后采用磁珠富集法獲取長薄鰍基因組中的四堿基重復單元微衛星片段，經過克隆、陽性鑒定后進行測序，最終篩選出的13個多態性高的微衛星位點，用SSRHunter軟件查找四堿基重復次數大于5的微衛星DNA序列；

（2）微衛星引物的設計：

在四堿基重復單元微衛星側翼，用軟件PRIMER3.0設計引物，引物長度為18-25bp，GC含量30-70%，退火溫度大于50℃，擴增片段的長度為100-350bp；

（3）微衛星標記標記引物的檢測：

對設計的微衛星標記引物進行PCR擴增，反應在MJ-100PCR儀上進行，擴增程序為：94℃預變性2分鐘，35個循環，最后72℃延伸10分鐘。反應體系為：正反引物各0.2μM，0.2mM?dNTP，1×PCR?Buffer，2.0mM?Mg2+，Taq酶0.5U,10-50ngDNA模板，用蒸餾水補足到總體積到10μl。模板為隨機挑選的6個長薄鰍樣本。用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行檢測，銀染觀察微衛星條帶多態性情況，最后得到13對條帶清晰、多態性高的長薄鰍微衛星分子標記。

優選地，所述步驟（3）中，35個循環的條件為94℃變性40秒,52-65℃退火30秒，72℃延伸40秒。

進一步地，所述13對長薄鰍微衛星分子標記，可以為長薄鰍分子輔助育種提供有力工具，同時有助于長薄鰍遺傳學和分子生物學的進一步研究。

本發明具有以下優點：

本發明是一種長薄鰍四堿基重復單元微衛星分子標記的構建方法，利用該構建方法得到的13對引物能在長薄鰍樣本中擴展出條帶清晰、多態性高的微衛星條帶。本發明開發的微衛星分子標記，可以為長薄鰍分子輔助育種提供有力工具，同時有助于長薄鰍遺傳學和分子生物學的進一步研究。

附圖說明

圖1為本發明實施例中Lef3位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖2為本發明實施例中Lef4位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖3為本發明實施例中Lef5位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖4為本發明實施例中Lef7位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖5為本發明實施例中Lef10位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖6為本發明實施例中Lef11位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖7為本發明實施例中Lef14位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖8為本發明實施例中Lef17位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖9為本發明實施例中Lef23位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖10為本發明實施例中Lef24位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；

圖11為本發明實施例中Lef31位點的微衛星引物擴增24個長薄鰍DNA的銀染圖；