[發(fā)明專利]一種新的腺病毒載體及其生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310064880.4
• 申請(qǐng)日: 2013-03-18
• 公開（公告）號(hào): CN103146753A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫在仁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東維真生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;C12N15/66;C40B40/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種新的腺病毒載體及其生產(chǎn)方法，具體涉及一種高通量腺病毒載體及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

腺病毒載體是轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞最有效的，多樣化的系統(tǒng)，它被廣泛的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)研究和基因療法領(lǐng)域。腺病毒載體能夠有效的轉(zhuǎn)染分裂或不分裂的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到百分之百。腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞后不整合到人類基因組，所以它相對(duì)比較安全。

腺病毒的生產(chǎn)比較容易達(dá)到很高的滴度，并且能夠容納多達(dá)30kb以上的外源基因。腺病毒重組蛋白的表達(dá)可以達(dá)到20-30%的細(xì)胞重量。盡管腺病毒載體有很多優(yōu)點(diǎn)，但是它的生產(chǎn)過(guò)程比較繁瑣，生產(chǎn)周期也比較長(zhǎng)。一個(gè)腺病毒的生產(chǎn)大約需要6-8周的時(shí)間。到目前為止還沒有高通量的生產(chǎn)技術(shù)。

腺病毒是線性的，雙鏈DNA病毒。因?yàn)樗腥f(wàn)六千個(gè)堿基對(duì)，所以直接克隆外源的基因會(huì)非常困難。克隆外源基因到腺病毒載體有很多種不同的方式，但最常見的是Agilent的pAdEasy^TM系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)利用大腸桿菌(Escherichia?coli)BJ5183和同源重組的方式。重組是在一個(gè)含有外源基因的穿梭載體和含有腺病毒基因組的質(zhì)粒載體之間進(jìn)行的。然而BJ5183生長(zhǎng)緩慢，質(zhì)粒產(chǎn)量非常微量。因?yàn)橛脕?lái)重組的一整套酶在該細(xì)胞株中一直處于表達(dá)狀態(tài)并始終存在于細(xì)胞內(nèi)，所以重組后的腺病毒在該細(xì)胞內(nèi)非常不穩(wěn)定。為了對(duì)重組后的DNA做酶切或測(cè)序分析，BJ5183提到的微量質(zhì)粒必須再次轉(zhuǎn)化到一個(gè)常用的細(xì)菌株里面去獲得更多的質(zhì)粒。在穿梭載體和腺病毒骨架載體在BJ5183細(xì)菌內(nèi)重組之后，正確的重組一般是在瓊脂盤上看上去比較小的菌落，但小的菌落很多時(shí)候并不是正確的重組。為了找到一個(gè)正確的重組，需要挑8-12個(gè)菌落做質(zhì)粒提取，酶切和測(cè)序分析。整個(gè)重組的效率非常低，過(guò)程繁瑣復(fù)雜。

pAdEasy^TM系統(tǒng)中的穿梭載體含有非常有限的幾個(gè)酶切點(diǎn)，它不能滿足對(duì)整個(gè)人源基因組的克隆。且重組之前穿梭載體需要用PmeI酶切，線性化，但是許多人類的基因本身含有PmeI。重組之后，含有外源基因的腺病毒載體需要用PacI線性化，同樣很多人類的基因含有該酶切點(diǎn)。該系統(tǒng)中的穿梭載體遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)人類整個(gè)基因組的腺病毒基因克隆的生產(chǎn)。

此外，其他的常用的腺病毒生產(chǎn)方式雖各有優(yōu)缺點(diǎn)，但都不能用來(lái)做高通量腺病毒的生產(chǎn)。而且與pAdeasy^TM系統(tǒng)相比，其他幾種方式更難操作，更不可靠。?

發(fā)明內(nèi)容

由于目前腺病毒載體的生產(chǎn)過(guò)程比較繁瑣，生產(chǎn)周期也比較長(zhǎng)。一個(gè)腺病毒載體的生產(chǎn)大約需要6-8周的時(shí)間。到目前為止還沒有高通量的生產(chǎn)技術(shù)。所以本發(fā)明要解決的主要的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種高通量高效率的生產(chǎn)腺病毒載體的方法。

由于現(xiàn)有的常用的穿梭載體只有幾個(gè)常見的酶切點(diǎn)，重組之前和之后分別需要用PmeI和PacI線性化質(zhì)粒，但很多人類的基因含有這兩個(gè)酶切點(diǎn)。故需要設(shè)計(jì)新的少見的酶切點(diǎn)去覆蓋人類基因組里面所有的克隆。所以本發(fā)明解決的另一個(gè)問(wèn)題是構(gòu)建一個(gè)可以用來(lái)克隆整個(gè)人類基因組的穿梭載體。

現(xiàn)有穿梭載體的構(gòu)建效率低，目前的穿梭載體除了不能用來(lái)克隆人類所有的基因以外，也無(wú)法用來(lái)做高通量的生產(chǎn)。所以本發(fā)明解決的再一個(gè)問(wèn)題就是提供一種高通量腺病毒穿梭載體的構(gòu)建方法。

傳統(tǒng)的方式是用BJ5183細(xì)菌株來(lái)做重組。因?yàn)橹亟M的整個(gè)機(jī)制一直處于表達(dá)狀態(tài)，重組后的腺病毒載體在BJ5183細(xì)菌內(nèi)也不穩(wěn)定。為了達(dá)到既可以用來(lái)重組，又可以用來(lái)做質(zhì)粒的擴(kuò)增的目的，就要求參與重組的幾個(gè)酶只在重組之前作簡(jiǎn)短的表達(dá)，重組之后不再表達(dá)，這樣腺病毒在這個(gè)細(xì)菌株內(nèi)可以穩(wěn)定擴(kuò)增。所以本發(fā)明解決的還一個(gè)問(wèn)題是采用一種可用于穿梭載體和腺病毒骨架載體重組的細(xì)菌株，使其不僅能夠用來(lái)做腺病毒載體重組，又能夠用來(lái)進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。

現(xiàn)有的穿梭載體和腺病毒骨架載體之間的重組方法時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高。目前常用的重組方法有兩步，一是穿梭載體和腺病毒骨架載體先在BJ5183細(xì)菌中重組，挑8-12個(gè)菌體質(zhì)粒小提；二是再轉(zhuǎn)化到另外一個(gè)普通的菌種中作培養(yǎng)，質(zhì)粒小提，酶切和測(cè)序。目前的技術(shù)是對(duì)基因一個(gè)一個(gè)的重組，整個(gè)周期需要8-10天時(shí)間，并需要大量試驗(yàn)試劑。所以本發(fā)明解決的最后一個(gè)問(wèn)題是提供一個(gè)新的高通量的重組方法，利用本發(fā)明方法進(jìn)行重組，不僅縮短時(shí)間，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)際的重組效率也大大提高。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)施：