[發明專利]一種新的腺病毒載體及其生產方法

有效

• 申請號: 201310064880.4
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN103146753A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 孫在仁
• 申請（專利權）人: 山東維真生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;C40B40/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種新的腺病毒載體，其特征在于，一是把外源的基因克隆到穿梭載體里面，二是穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組，腺病毒骨架載體內克隆進了一個表達ISceI的酵母基因。

2.如權利要求1所述的一種新的腺病毒載體，其特征在于，所述的外源基因為哺乳動物的基因，或為人類的基因。

3.如權利要求1所述的一種新的腺病毒載體，其特征在于，所述的穿梭載體是pCMV-FH。

4.如權利要求3所述的一種新的腺病毒載體，其特征在于，所述的pCMV-FH是對pShuttle-CMV載體的改造而得，包括在PacI的外面添加SwaI酶切位點，在PmeI之內添加IsceI酶切位點，和外源基因插入酶切點的改變；所述的外源基因插入酶切點的改變是把T7細菌啟動子、Kozak序列和用來插入外源基因的5個酶的組合：AsiSI/MluI，AsiSI/RsrII，AsiSI/NotI，AscI/MluI，AsiSI/XhoI，以及His和Flag標簽合成之后，用KpnI/XbaI酶切，然后連接到KpnI/XbaI酶切的穿梭載體上；對pShuttle-CMV載體的改造還包括縮短左、右同源臂和在5’端增加了一個Kozak序列；對pShuttle-CMV載體的改造還包括插入嘌呤霉素Puromycin基因、SV40啟動子和BGH?PolyA?信號。

5.一種權利要求1所述新的腺病毒載體的生產方法，其特征在于，穿梭載體克隆方法及穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組方法均采用高通量的生產方法。

6.如權利要求5所述新的腺病毒載體的生產方法，其特征在于，所述的高通量穿梭載體的克隆方法是：首先將人類每個基因的ORF用PCR進行擴增，然后把50個大小相似的ORF的PCR產物合到一起，酶切，連接到穿梭載體；轉化，細菌培養后，挑96個菌體，質粒小提，進行測序和序列分析；一個96孔板可以得到30-35個不同的克隆，第一輪就能把9，000-10，000個人源的基因克隆到穿梭載體內；對第一輪沒有克隆到的基因，根據大小重新把50個克隆合到一起，酶切，連接和轉化；重復操作至第五輪就可以把99%的基因克隆到穿梭載體內。

7.如權利要求5所述新的腺病毒載體的生產方法，其特征在于，所述的高通量的穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組方法是：首先將50個不同的穿梭載體克隆合到一起，用PmeI或ISceI酶切線性化之后，轉化到含有腺病毒載體的感受態細菌之內；平板過夜培養，然后挑96個菌體作質粒小提，測序和序列分析；一次轉化和96樣品分析可以獲得30-35個不同的重組腺病毒克隆；對第一次沒有得到重組的克隆，再合到一起進行第二輪的重組；以此重復操作至第五輪就可以把99%的穿梭載體克隆重組到腺病毒載體之內。

8.如權利要求1所述的一種新的腺病毒載體，其特征在于，所述的腺病毒載體可用來做成基因芯片。