[發(fā)明專利]一種脂肪干細(xì)胞-生物材料復(fù)合物凍存液及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310063006.9
• 申請(qǐng)日: 2013-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN104012519A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴建英;劉占杰;張澤宇;俞鐵鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州啟迪生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 張睿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物凍存液和脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的處理方法。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)深低溫凍存要求精確的降溫速率控制，操作復(fù)雜，但仍無法避免在降溫過程中出現(xiàn)冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害。玻璃化凍存方法很好地解決了這個(gè)問題。在玻璃化過程中，物質(zhì)并不結(jié)晶，而是形成一種超冷凍液體，外觀接近固體，但仍保持著作為液體特征的分子無序性。細(xì)胞或組織在玻璃化過程中受到的損傷降到了最小。

脂肪來源干細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖及成骨能力，且采集時(shí)對(duì)病人造成的創(chuàng)傷較小，臨床應(yīng)用潛能較大。組織工程骨構(gòu)建技術(shù)與玻璃化凍存的結(jié)合為臨床應(yīng)用提供了更大的便利性和更多的選擇性。

因此本領(lǐng)域迫切需要提供簡便而有效地凍存以脂肪來源干細(xì)胞為種子細(xì)胞的種子細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的凍存液。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種如上述的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的凍存液的用途。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的處理方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物凍存液，所述的凍存液中含有：0.2-0.8mol/L海藻糖；和10-40m/v%促紅細(xì)胞生成素。

在另一優(yōu)選例中，所述的凍存液中含有：0.4-0.8mol/L海藻糖；和20-38m/v%促紅細(xì)胞生成素。

更佳地，所述的凍存液中含有：0.6-0.8mol/L海藻糖；和25-35m/v%促紅細(xì)胞生成素。

在另一優(yōu)選例中，所述凍存液含有余量的無血清DMEM培養(yǎng)液。

最佳地，所述凍存液含有0.8mol/L海藻糖，30m/v%促紅細(xì)胞生成素和余量的無血清DMEM培養(yǎng)液。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上所述的本發(fā)明提供的凍存液的用途，所述的凍存液可用于保存脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的處理方法，所述的方法包括步驟：

（1）將脂肪干細(xì)胞接種脫鈣骨，使用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)；

（2）將步驟（1）得到的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物和如上所述的本發(fā)明提供的凍存液混合；和

（3）將與凍存液混合的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物在液氮中凍存，得到冷凍保存的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：

（4）將冷凍保存的脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物在40－80℃水浴復(fù)溫。

更佳地，復(fù)溫3－8天，最佳地為4－6天。

據(jù)此，本發(fā)明提供了簡便而有效地凍存以脂肪來源干細(xì)胞為種子細(xì)胞的種子細(xì)胞-生物材料復(fù)合物的方法。

附圖說明

圖1顯示了不同組分凍存液凍存后細(xì)胞存活率變化。

圖2顯示了不同組分凍存液凍存后堿性磷酸酶活性變化。

圖3顯示了不同組分凍存液凍存后骨鈣素分泌變化。

圖4顯示了Design-expert（軟件名稱，用于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，為本領(lǐng)域并不限于本領(lǐng)域的公認(rèn)頂級(jí)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，美國Stat-Ease,Inc公司產(chǎn)品）運(yùn)行多響應(yīng)優(yōu)化結(jié)果，即分類因素水平的16個(gè)組合的結(jié)果。

圖5顯示了復(fù)蘇后細(xì)胞生長曲線。

圖6顯示了復(fù)蘇后堿性磷酸酶活性。

圖7顯示了凍存與未凍存的細(xì)胞-支架復(fù)合物對(duì)骨修復(fù)效果相同。

具體實(shí)施方式

發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了一種脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物的冷凍保存液，它可以長久而有效地保持脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物中脂肪干細(xì)胞的存活率、及其細(xì)胞功能。另外，發(fā)明人針對(duì)多個(gè)優(yōu)化目標(biāo)，采用期望函數(shù)（The?desirability?function）的多響應(yīng)優(yōu)化方法，將每個(gè)響應(yīng)轉(zhuǎn)換成期望函數(shù)，并求得期望函數(shù)的幾何平均值即為最終的響應(yīng)目標(biāo)。

具體地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以將脂肪干細(xì)胞-脫鈣骨復(fù)合物和含有海藻糖和促紅細(xì)胞生成素的溶液混合后，進(jìn)行凍存。

如本文所用，“促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin;erythrogenin;EPO)”是指在哺乳動(dòng)物腎臟和肝臟產(chǎn)生的一種分子質(zhì)量為46kDa的糖蛋白細(xì)胞因子；能刺激幼稚紅細(xì)胞的增生，血紅蛋白化和紅細(xì)胞的成熟。

如本文所用，“脂肪干細(xì)胞(Adipose?derived?stem?cells，ADSCs)”是指從脂肪組織中得到的具有增殖分化能力的干細(xì)胞。更佳地，指同時(shí)具有多向分化能力的脂肪干細(xì)胞。