[發(fā)明專利]大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310062950.2
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103103195A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳伶利;葛金文;李杰;張曉青;程莉娟;周賽男;宋嵐
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;A61K48/00;A61P31/04
• 代理公司: 北京聿宏知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;劉華聯(lián)

1.特異結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。

2.權(quán)利要求1所述的適配體，具有如下序列：SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?IDNO：12、SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15、SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17、SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19或SEQ?ID?NO：20。

3.按權(quán)利要求1或2所述的適配體，其特征在于，通過下述方法制得：

采用核酸適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，以大腸桿菌外膜蛋白TolC為篩選靶標(biāo)，從體外合成的寡聚DNA文庫中篩選出與TolC蛋白特異結(jié)合的核酸適配體，所述文庫的序列為

5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。

4.按權(quán)利要求3所述的適配體，其特征在于，所述大腸桿菌外膜蛋白TolC采用如下方法純化得到：

采用分子克隆技術(shù)，根據(jù)大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設(shè)計(jì)特異引物，所述特異引物之上游引物Pa為

5’-CGGGATCCATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTT‐3’，其下游引物Pb為5’‐CCGCTCGAGGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTT‐3’，以全長cDNA為模板，PCR擴(kuò)增，得到目的基因經(jīng)Bam?H?I和Xho?I雙酶切，同樣處理PET-30a質(zhì)粒，再用T4連接酶連接制得含有TolC基因的重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)固液分離，取沉淀經(jīng)超聲粉碎，然后電泳；再采用柱層析純化所述大腸桿菌外膜蛋白TolC。

5.按權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的適配體，其特征在于，所述序列為人工合成的序列，或任何其他來源的同樣的序列。

6.按權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的適配體，其特征在于，所述序列在制備藥物或制品中的用途。

7.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的適配體，其特征在于，所述序列在制備大腸桿菌外排泵抑制劑中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的適配體，其特征在于，所述序列在制備檢測TolC蛋白的探針或靶點(diǎn)中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求1所述的適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑或制備檢測TolC蛋白的探針或靶點(diǎn)中的應(yīng)用。

10.抑制大腸桿菌外排泵外排活性或減少大腸桿菌外排泵外排的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的適配體。