[發明專利]sH2a定量檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201310062296.5
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103336125A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 陳菲;霍如松;朱凡
• 申請（專利權）人: 蘇州和銳醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及免疫分析檢測領域。具體而言，本發明涉及一種定量檢測sH2a蛋白的免疫分析檢測試劑盒。?

技術背景

sH2a是一種在肝臟特異性表達的可溶性分泌型蛋白，分子量約35KD。它與另一種也只在肝細胞表達的去唾液酸受體蛋白(ASGPR)的H2亞基同源，但研究表明，sH2a并不參與ASGRP?H2亞基的組裝。sH2a的前體蛋白在肝細胞表達出來后，在內質網被剪切去約5個氨基酸成sH2a后，即被釋放到細胞外，進入血液循環。正常人外周血中sH2a蛋白保持較高水平，但在肝損傷、肝炎、肝纖維化等肝病患者中sH2a的蛋白含量顯著下降，因此，通過檢測患者血中sH2a含量可獲得肝臟功能狀況的信息，可作為臨床肝損傷、肝炎、肝纖維化等肝病的輔助診斷。?

本發明是在發明號200480013005.2的發明基礎上，對sH2a蛋白檢測技術進行了優化，改變了原發明檢測方法穩定性差，檢測靈敏度低、特異性差、只能定性不能定量等問題，用更為穩定的雙抗夾心法代替了原來的競爭性ELISA法，并且在包被、封閉、顯色等環節進行了工藝改進，形成了成熟的可用于臨床及實驗室檢測的sH2a定量檢測試劑盒。本發明試劑盒具有定量、穩定性好、靈敏度高、特異性強、準確度高等優點。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種穩定性好、靈敏度高、特異性強、準確度高的定量檢測sH2a的免疫分析檢測試劑盒，具體來說是檢測人sH2a的定量免疫分析檢測試劑盒。?

本發明提供了一種檢測sH2a定量檢測試劑盒，其中包括：包被有sH2a特異性抗體的微孔板、sH2a蛋白標準品、酶標記抗人sH2a單抗、底物顯色劑、洗滌液、反應終止液、樣品稀釋液。?

其中sH2a特異性抗體是指識別sH2a至少一個抗原表位的多克隆抗體，或者更優地，是指識別sH2a至少一個抗原表位的單克隆抗體。?

所述的sH2a酶標記抗人sH2a單克隆抗體是指由保藏號B904030801的B9雜交瘤細胞所產生。?

當包被的抗體是單克隆抗體時，其抗原表位與酶標記單克隆抗體的抗原表位不同。?

所述的sH2a酶標記抗人sH2a單克隆抗體是辣根過氧化物酶標記的抗體。?

所述的酶標記抗人IgG抗體采用化學方法偶聯得到，標記酶為辣根過氧化物酶，所述偶?聯方法為改良過碘酸鈉法。?

用于制備所述酶標板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應板凹孔。?

所述的洗滌液為0.05％tween20的磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1∶1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。所述的樣品稀釋液為含0.5％BSA的磷酸鹽緩沖液，所述的抗體稀釋也為含0.5％BSA的磷酸鹽緩沖液。?

本發明的另一方面，提供了一種定量檢測血清或血漿中sH2a蛋白含量的方法，包括步驟：?

(1)用權利要求1-11任一所述的試劑盒進行檢測，向sH2a特異性抗體C包被的微孔板中加入sH2a蛋白標準品或待測樣品溶液，孵育后洗滌拍干，再加入酶標記的抗人sH2a單克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑、終止液，用酶標儀或化學發光儀測定吸光度值；?

(2)分析檢測結果。?

本發明試劑盒的檢測原理為：?

將抗sH2a的特異性抗體包被在固相載體上，加入待檢測樣品或sH2a標準蛋白，樣品或標準品中的sH2a蛋白就跟固相載體上的抗sH2a特異性抗體結合，形成抗原-抗體復合物，用洗滌液去除無關的成分，然后加入酶標記的抗人sH2a單克隆抗體，酶標抗體與微孔板上的抗原-抗體結合，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，通過洗滌出去未結合的酶標記物，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與標準品中含sH2a蛋白的量呈正相關(圖1)，用不同濃度梯度的標準品溶液制作標準曲線，即可計算出樣品中sH2a的含量。?

附圖說明

圖1為sH2a標準品繪制的標準曲線.?

圖2為實施例1中重組蛋白SDS-PAGE圖。圖2.重組蛋白SDS-PAGE?M.蛋白標準分子量marker?1.空載體菌?2.裂解后的重組菌?3.純化后的重組蛋白?

圖3為實施例1中重組蛋白western?blotting圖。圖3.重組蛋白western?blot?M.蛋白標準分子量marker?1.空載體菌?2.純化后的重組蛋白?

圖4為實施例5中樣本檢測結果。圖4樣本sH2a蛋白水平檢測?

具體實施方式