[發明專利]黃瓜黑色果刺基因B連鎖的SSR標記引物及其應用

有效

• 申請號: 201310061177.8
• 申請日: 2013-02-27
• 公開（公告）號: CN104004749A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 張圣平;顧興芳;苗晗;劉書林;王燁
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明涉及生物技術輔助育種領域，特別是黃瓜黑色果刺基因B連鎖的SSR標記及其在黃瓜育種材料選擇中的應用。

背景技術

黃瓜（Cucumis?sativus?L.）是世界十大蔬菜之一，因其風味清香、口感脆爽，深受各國消費者的喜愛。隨著消費水平的提高，人們對黃瓜品質的重視程度與日俱增。品質育種已成為黃瓜育種的重點之一。黃瓜果實品質包括外觀品質和內在品質。通常說的品質性狀主要指商品性即外觀品質，包括瓜色、瓜長、果刺多少、果刺顏色、果瘤大小、果色均勻度、光澤度等。果刺顏色作為重要的商品性狀之一，對商品銷售影響很大。一般來說，市場上需求白色果刺的黃瓜。研究黃瓜果刺顏色的遺傳規律及分子標記，對于選育符合市場需求的黃瓜新品種具有重要意義。

關于控制黃瓜果刺顏色的基因，已報道的有四個黑刺基因，分別為B、B-2、B-3、B-4。前人對于果刺顏色的遺傳規律進行了多項研究。本世紀初Wellington首次報道了了控制黃瓜黑色果刺的基因（B），黑刺（B）對白刺（b）為顯性。Strong（1931）和Tkachenko（1935）的研究也表明，黃瓜黑刺或棕刺對白刺為顯性。1971年，Shanmugasundarum等（1971a）報道了不同于B基因的第二個黑色果刺基因B-2，該基因與B互作，F₂后代分離比為15（黑）：1（白）。Cowen?and?Helsel（1983）利用LJ90430和MSU41為試材，證實了存在于野生黃瓜LJ90430兩個黑色果刺基因B-3和B-4，且兩基因存在互作，F₂后代分離比為9（黑）：7（白）。

目前，有關黃瓜果刺顏色分子水平的研究，所見報道不多。Kennard等（1994）利用黃瓜栽培種與野生種雜交獲得F₂群體，構建了一個70位點的分子連鎖圖，包括61個RFLP標記，5個同工酶標記(Mpi-1、ldh、pgm-1、pep-pap和per)、2個形態標記(F和B)和2個抗病標記(dm和Ccu)，獲得了與黑色果刺基因B連鎖的RFLP標記Csp130，遺傳距離為5cM。Heang等（2008）獲得了一個與B基因連鎖距離為14.5cM的AFLP標記ECACMCTC150。苗晗等（2011）將果刺顏色作為數量性狀來研究，并在Chr4和Chr5上均檢測到主效QTL位點，并將B定位在了Chr4上SSR02697-SSR19256內和Chr.5上SSR15818-SSR06003內。可見，到目前為止，與質量性狀基因B緊密連鎖的SSR標記尚未見報道。

發明內容

本發明基于上述領域的空白，提供了與黃瓜黑色果刺基因B緊密連鎖的SSR標記，并提供了其在選擇黃瓜果刺顏色種質資源上的應用。

本發明的技術方案如下：

黃瓜黑色果刺基因B緊密連鎖的SSR標記引物，其特征在于：

SSR07209-F/SSR07209-R:

CTGTCTGCAGAGCCATCTGA/CCATCAAGTTGAGGAGCAAA；

所述SSR標記引物擴增的與黃瓜白色果刺基因b連鎖的特征條帶為192bp，核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示；

所述SSR標記引物擴增的與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的特征條帶為178bp，核苷酸序列如和Seq?ID?No.2所示。

上述SSR標記引物在篩選具有白色果刺基因b的黃瓜種質資源中的應用，其步驟如下：

（1）采用上述SSR標記引物對待選黃瓜品種的基因組DNA分別進行PCR擴增；

（2）對擴增結果進行凝膠電泳檢測；

（3）從檢測結果中選出出現與黃瓜白色果刺基因b連鎖的特征條帶的材料，去掉出現與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的特征條帶的材料。

所述PCR反應體系為:7.5ng?DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL?Go?TaqGreenMaster?Mix，加雙蒸水至10ul。

所述PCR擴增程序為：94℃預變性4分鐘；94℃變性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35個循環；72℃保溫5分鐘，16℃保存。

所述凝膠電泳檢測：指采用6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。