[發明專利]單唾液酸四己糖神經節苷脂的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201310059889.6
• 申請日: 2013-02-26
• 公開（公告）號: CN103087120A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 黃曉霞;屈英薇;張洋
• 申請（專利權）人: 北京四環制藥有限公司;北京澳合藥物研究院有限公司;長春翔通藥業有限公司
• 主分類號: C07H15/10
• 分類號: C07H15/10;C07H1/00;A61K31/7032;A61P25/28;A61P9/10;A61P9/00;A61P25/16
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技術領域

本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及單唾液酸四己糖神經節苷脂的制備方法及其應用。

背景技術

神經節苷脂(ganglioside，Gls)是一類含唾液酸的膜糖脂/鞘糖脂，由親水的寡糖鏈和親脂的神經酰胺兩部分組成。神經節苷脂位于神經元細胞的雙層結構外層，為大多數哺乳動物細胞膜的組成成分和大腦形成記憶的重要物質，因其最早被發現于神經節細胞而得名。

單唾液酸四己糖神經節苷脂（Monosialotetrahexosylganglioside，GM1）為乳白色粉末，無味，有吸濕性，分子量為1551（GM1鈉鹽的分子量為1574），溶于水、甲醇-水、甲醇-氯仿，不溶于甲醇、丙酮、氯仿、乙醚，熔點為207-230℃，其紫外吸收最大波長位于205nm，可通過氨基正相高效液相色譜和薄層色譜（TLC）進行純度鑒定，氣相色譜可鑒定GM1分子中的糖基和神經酰胺殘基。

能嵌入神經細胞膜，模仿內源性神經節苷脂的某些功能，調節膜介導的細胞功能，并刺激中樞神經系統損傷后潛在的代替機制而阻止損害的發生，保護未受損的神經組織，還能影響體外培養的神經元生長及其活性，促進其存活及生長。神經節苷酯GM1在神經系統的主要生理作用包括：1）促進神經細胞的生長、分化發育和神經再生；2）參與突觸傳遞，維持腦的正常機能，參與各種記憶活動；3）在細胞與細胞、細胞與微生物、細胞與基質間的相互作用中起到介導作用；4）調節細胞膜中各種蛋白質功能，如離子通道、表皮生長因子受體等。

能通過血腦屏障，注射后快速在大腦和脊髓組織中分布，臨床治療效果十分顯著，主要用于治療血管性中樞神經系統疾病或創傷性中樞神經系統疾病，如腦卒中、脊髓損傷、腦外傷、各種慢性病后期的神經功能障礙、腦萎縮、阿爾茨海默病、帕金森氏病、腦血管意外、智力障礙等。意大利Fidia公司從牛腦組織中提取的GM1注射液（商品名Sygen）已于20世紀90年代在我國銷售。

哺乳動物腦組織中主要包括GM1、GD1a、GD1b和GT1b等神經節苷脂成分。這些成分中的寡糖鏈和神經酰胺部分結構一致，主要差異在于寡糖鏈上唾液酸分子的位置和數量。其中，GD1a和GD1b的糖鏈上有兩個唾液酸，但各自位置不同；GT1b的糖鏈上有三個唾液酸；GM1的糖鏈上有一個唾液酸。GD1a、GD1b和GT1b寡糖鏈上的唾液酸基團在酸性或酶催化條件下可降解，進而制得GM1。

公開了單唾液酸四己糖神經節苷脂的制備方法，該方法使用混合溶劑（氯仿：甲醇：水的體積比為1:2:0.75）從哺乳動物腦組織中提取總神經節苷酯，濃縮總神經節苷酯提取液后再進行酸水解（pH3.0-5.0）以提高GM1含量，濃縮水解產物經脫鹽后溶解于混合溶劑（氯仿：甲醇：水的體積比為1:2:1.4）中進行陰離子交換柱層析（如Q-Sepharose?F.F.或DEAE-?Sepharose），其中，腦組織與混合溶劑的體積比為1：20，收集含GM1的洗脫峰，濃縮后再進行反相柱層析（SourcRPC30），所得GM1于冷丙酮中沉淀，收集沉淀，干燥，即得。該文獻報道的GM1純度大于98%，但存在操作復雜、制造成本高，難于工業化生產等缺陷。

目前，GM1主要來源于動物腦組織，從動物腦組織中提取總神經節苷酯混合物的方法業已成熟穩定，GM1產率的增加關鍵在于提高神經節苷脂混合物中其他神經節苷脂轉化為GM1的轉化率。多采用微生物轉化法和無機酸轉化法來提高神經節苷脂GM1的產率。微生物轉化法是從土壤中篩選培養具備降解唾液酸活性的微生物菌落，使其與神經節苷脂混合物共同發酵培養，微生物在代謝過程中表達一種具備唾液酸降解活性的蛋白酶，專一高效地實現神經節苷脂的轉化。然而，天然微生物在與神經節苷脂共同孵化培育過程中，會產生大量的菌體異源蛋白質和異源DNA，進而導致嚴重的用藥安全隱患。無機酸轉化法則在神經節苷脂混合物溶液中加入鹽酸、硫酸或磷酸，調節pH值至3.0-5.0，保溫反應，即可。該方法操作簡單，所用化學試劑安全可靠，普遍用于GM1的生產。然而，該方法存在由神經節苷脂轉化為GM1的效率不理想，實際轉化率僅有理論轉化率的60％左右，約有40％的GM1被過度酸化為脫唾液酸神經節苷脂GA1。