[發明專利]一種快速誘導及繁殖棉花胚性愈傷的方法

無效

• 申請號: 201310059805.9
• 申請日: 2013-02-26
• 公開（公告）號: CN103120127A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 宋純鵬;王道杰;鄭軍;王宏亮
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 田小伍;楊海霞

技術領域

本發明屬于植物組織誘導和培養技術領域，具體涉及一種快速誘導及繁殖棉花胚性愈傷的方法。

背景技術

棉花是是重要的經濟作物之一，長期以來，常規育種技術在作物新品種選育工作中發揮了重大作用。但是常規育種是通過對育種材料表型性狀的選擇來實現對目標基因型的選擇，人們無法直接考察個體的基因型，只能從表現型推測基因型。而且常規育種具有很大的盲目性和不可預測性，隨著生物技術的發展，常規育種的效率低等問題也更加明顯。

隨著轉基因技術的發展，棉花的新資源創制和新品質選育也獲得顯著的成就，比如：抗旱，抗鹽，抗蟲棉花。目前，常用的棉花遺傳方法有農桿菌介導法，基因槍法等。由于基因槍等其它轉基因方法都有一定的局限性，且不能在短時間獲得大量的轉基因棉花。而通過農桿菌介導法可以獲得大批量的轉基因植株。

通過農桿菌侵染胚性愈傷可以快速獲得轉基因植株，然而由于棉花的外植體分化能力比較難，一直是農桿菌侵染介導法的瓶頸。在棉花組織培養中，棉花的再生體系主要經歷以下幾個過程：外植體誘導成愈傷組織，愈傷組織分化為胚性愈傷組織，胚性愈傷組織分化成體細胞胚，最后分化成棉花幼苗。由于棉花從愈傷組織到胚性愈傷組織是棉花再生體系的主要環節，也是棉花再生體系的最艱難的一步。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術不足，提供一種快速誘導及繁殖棉花胚性愈傷的方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種快速誘導及繁殖棉花胚性愈傷的方法，其包括如下步驟：

1）將培養5－8d的棉花無菌苗的下胚軸切割成長度為0.4－0.8cm的片段，然后置于培養基A或培養基B中于25－28℃培養25－30d，每天光照12－16h，光強1500－1800?Lux，獲得愈傷組織；

2）將步驟1）中從培養基A中獲得的愈傷組織依次置于培養基B和C中于25－28℃分別繼續培養25－30d，每天光照12－16h，光強1500－1800?Lux，獲得胚性愈傷；將步驟1）中從培養基B中獲得的愈傷組織直接置于培養基C中于25－28℃繼續培養25－50d，每天光照12－16h，光強1500－1800?Lux，獲得胚性愈傷。

具體的，所述培養基A由碳源、MSB5培養基、IAA（吲哚-3-乙酸）、KT（6-呋喃甲基腺嘌呤）、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）和凝固劑組成；培養基A中的IAA濃度0.05－0.15mg/L，KT濃度0.05－0.15?mg/L，2,4-D濃度0.05－0.15?mg/L。

所述培養基B由碳源、MSB5培養基、IAA、KT、2,4-D和凝固劑組成；培養基B中的IAA濃度為0.05－0.15mg/L，KT濃度為0.01－0.1?mg/L，2,4-D濃度為0.01－0.1mg/L。

所述培養基C由碳源、MSB5培養基、IAA、KT、2,4-D和凝固劑組成；培養基C中的IAA濃度為0.05－0.15mg/L，KT濃度為0.01－0.1?mg/L，2,4-D濃度為0.01－0.1mg/L。

所述快速誘導及繁殖棉花胚性愈傷的方法，較好的，可以將步驟2）獲得的胚性愈傷先置于培養基D中培養于25－28℃培養15－25d獲得淺黃色的胚性愈傷，每天光照12－16h，光強1500－1800?Lux；若不出現分化現象，則繼續置于培養基D中培養，每15－20d為一個繼代周期；若出現分化現象，則置于培養基E中于25－28℃繼續培養15－25d，每天光照12－16h，光強1500－1800?Lux。

所述培養基D由碳源、MSB5培養基、IAA、6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）和Phytagel（植物凝膠，購自Solarbio公司）組成；培養基D中的IAA濃度為0.001－0.01?mg/L，6-BA濃度為0.001－0.01?mg/L，Phytagel濃度為2.0－3.0g/L。

所述培養基E由碳源、MSB5培養基、IAA、KT和Phytagel組成；培養基E中的IAA濃度為0.001－0.01mg/L，KT濃度為0.001－0.01?mg/L，Phytagel濃度為2.0－3.0g/L。

所用棉花選自普通陸地棉coker413，coker201或coker310。

本發明中，所述的碳源為葡萄糖，工作濃度為20－30g/L。所用的MSB5培養基組成見表1。