[發(fā)明專利]板式化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑通用固相包被板及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310055070.2
• 申請(qǐng)日: 2013-02-21
• 公開（公告）號(hào): CN104007102A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林斯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 林斯
• 主分類號(hào): G01N21/76
• 分類號(hào): G01N21/76;G01N33/68;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，應(yīng)用于醫(yī)療檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)。

背景技術(shù)

目前國內(nèi)外使用的板式化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑盒一般有兩種，一種是按檢測(cè)內(nèi)容物不同包被不同的包被抗體，進(jìn)而制成不同的固相包被板。每種固相包被板只能對(duì)應(yīng)應(yīng)用于一種檢測(cè)項(xiàng)目。人體可以用免疫診斷的指標(biāo)有數(shù)百種。因此要想全部生產(chǎn)出對(duì)應(yīng)的診斷試劑就需要生產(chǎn)數(shù)百種固相包被板。這對(duì)于生產(chǎn)和應(yīng)用都帶來了復(fù)雜性。另一種方法進(jìn)行了改良：將原來用于直接制備包被板的包被抗體標(biāo)記上熒光素或者生物素，然后將抗熒光素抗體或鏈親和素包被在固相板上。由于抗熒光素抗體會(huì)特異性的結(jié)合熒光素(或者鏈親和素會(huì)特異性的結(jié)合生物素)這樣就間接的將原來不同檢測(cè)項(xiàng)目的不同固相包被板簡化成統(tǒng)一的抗熒光素抗體包被板或者鏈親和素包被板。但是這里又引入了新的問題。由于抗體的空間結(jié)構(gòu)的多樣性導(dǎo)致生物素標(biāo)記包被抗體成功率只有50％左右，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)抗體與抗原特異性結(jié)合的可變區(qū)上的特異性氨基位點(diǎn)被生物素結(jié)合從而失去與抗原結(jié)合的能力。而熒光素標(biāo)記抗體雖然是與抗體上的二硫鍵結(jié)合不影響抗體與抗原結(jié)合的特異性，一般成功率大于90％。但是熒光素抗體與熒光素的反應(yīng)速率僅有鏈親和素與生物素結(jié)合反應(yīng)速率的萬分之一。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明公開了一種板式化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑通用固相包被板的制備方法，該方法可以使不同的檢測(cè)試劑用同一種通用包被板，大大減少生產(chǎn)的復(fù)雜性和增強(qiáng)應(yīng)用的簡便性。

本發(fā)明是合成一種新的蛋白用以制備一種通用包被板，這種通用包被板可以與鏈親和素和熒光素結(jié)合。然后在不同的檢測(cè)項(xiàng)目的包被抗體上標(biāo)記上生物素或者熒光素，間接的將包被抗體固定在通用包被板上。采用此發(fā)明前的包被板隨著項(xiàng)目不同而需要單獨(dú)生產(chǎn)，或者生物素標(biāo)記成功率低，或者熒光素結(jié)合速率慢，分別有各自的缺點(diǎn)。采用本發(fā)明后能最大限度的提高標(biāo)記成功率以及結(jié)合速率，還可以通用包被板，提高生產(chǎn)和應(yīng)用簡便性。

本發(fā)明的板式化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑通用固相包被板的制備方法包括如下步驟：

步驟1：取0.5～1.5mg分子量66KDa的鏈親和素和2.0～2.8mg分子量160KDa的抗熒光素抗體溶解于0.05～0.15ml、0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液中，加入攪拌子備用；

優(yōu)選取1mg分子的鏈親和素和2.4mg的抗熒光素抗體溶解于0.1ml的碳酸緩沖液中；

步驟2：取70％的戊二醛0.05～0.15ml用蒸餾水稀釋70倍成0.5～1.5％濃度備用；

優(yōu)選取戊二醛0.1ml稀釋成1％濃度備用；

步驟3：在步驟1制得的溶液中加入新鮮配制的1％戊二醛溶液0.05～0.15ml，室溫?cái)嚢?小時(shí)。取出反應(yīng)液加入透析袋，對(duì)0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液透析過夜，期間換液3次；要求透析袋透過直徑為160KDa；將透析后的反應(yīng)液加入等量甘油保存于-15～25℃；

優(yōu)選加入戊二醛溶液0.1ml；優(yōu)選將透析后的反應(yīng)液加入等量甘油保存于-20℃；

步驟4：將新合成的包被蛋白甘油溶液用0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液稀釋到1∶1000，在96孔化學(xué)發(fā)光板中每孔加入50～150μl稀釋溶液，3～5℃靜置過夜；次日將板子拍桿，加入含有1％牛血清白蛋白的溶液150～250μl，37℃封閉反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)；將板子再次拍干，置于烘干間抽濕烘干后真空包裝，得到板式化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑通用固相包被板。

優(yōu)選在化學(xué)發(fā)光板中每孔加入100ul稀釋溶液，4℃靜置過夜；優(yōu)選加入含有1％牛血清白蛋白的溶液200μl，37℃封閉反應(yīng)1小時(shí)。

通過本發(fā)明的方法制得的包被板，可以使得生產(chǎn)企業(yè)無論生產(chǎn)哪種類型的板式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，都可以使用通用包被板。有利于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，減少半成品類型和批次，減少質(zhì)量檢驗(yàn)步驟，可提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和質(zhì)量。

對(duì)于使用者，所有的檢測(cè)項(xiàng)目的固相包被板通用可減少同時(shí)檢測(cè)多個(gè)項(xiàng)目導(dǎo)致操作失誤。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的制備方法進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：

取1mg鏈親和素(分子量66KDa)和2.4mg抗熒光素抗體(分子量160KDa)溶解于0.1ml0.05M?pH9.6的碳酸緩沖液中，加入攪拌子備用。

取70％的戊二醛0.1ml用蒸餾水稀釋70倍成1％濃度備用。