[發明專利]基于分子標記技術的刀鱭林氏異鉤鋏蟲的檢測及驅除方法

無效

• 申請號: 201310051777.6
• 申請日: 2013-02-02
• 公開（公告）號: CN103224982A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 徐鋼春;聶志娟;顧若波;徐跑
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于分子標記技術的刀鱭林氏異鉤鋏蟲的檢測及驅除方法，其特征在于，該方法利用普通光學顯微鏡與分子遺傳相結合方法，對寄生刀鱭的異鉤鋏蟲進行種屬鑒定；

首先，鏡檢顯示：蟲卵階段卵兩端具有較長的極絲；

蟲體階段含有四對不對稱的后吸器，具短柄，其中一側的前2個開放幾丁質吸鋏明顯大于其余6個封閉的吸鋏，蟲體尾部帶有二對尖銳的彎鉤；

然后分子遺傳擴增28S?rRNA基因5′端部分序列，測定林氏異鉤鋏蟲28s序列，經比對分析，即可準確鑒定此寄生蟲為林氏異鉤鋏蟲；

鑒定完畢后，用lmg/L濃度的甲苯咪唑全池潑灑，72小時后，蟲體可脫落、死亡；同時，還要及時換水50％-60％，排出脫落的蟲卵，防止以后復發。

2.如權利要求1所述的基于分子標記技術的刀鱭林氏異鉤鋏蟲的檢測及驅除方法，其特征在于，該檢測方法的具體步驟為：

采集樣品宿主刀鱭，隨機抽查30條刀鱭，平均體長12厘米，體重5克，在顯微鏡下觀察鰓部寄生蟲并統計其數量，部分蟲體清水沖洗干凈至95％的酒精保存；

進行形態結構觀察，肉眼觀察，將帶有寄生蟲刀鱭取出魚鰓并置載玻片上，解剖鏡下觀察并將有蟲體的鰓絲挑出，放入離心管清水清洗數次后再置顯微鏡下觀察拍照；

進行分子鑒定，首先制備模板DNA，進行pcr擴增及擴增片段克隆，DNA序列拼接后，登錄NCBI進行blast比對分析，并下載相似性較高的序列；ClustalX多序列比對后采用MEGA軟件中鄰接法構建了28S?rDNA分子進化樹。

3.如權利要求2所述的基于分子標記技術的刀鱭林氏異鉤鋏蟲的檢測及驅除方法，其特征在于，采集樣品宿主刀鱭，隨機抽查30條刀鱭，平均體長12厘米，體重5克，在顯微鏡下觀察鰓部寄生蟲并統計其數量，部分蟲體清水沖洗干凈至95％的酒精保存。

4.如權利要求2所述的基于分子標記技術的刀鱭林氏異鉤鋏蟲的檢測及驅除方法，其特征在于，肉眼觀察，將帶有寄生蟲刀鱭取出魚鰓并置載玻片上，解剖鏡下觀察并將有蟲體的鰓絲挑出，放入離心管清水清洗數次后再置Olympus0.5X顯微鏡下觀察拍照。

5.如權利要求2所述的基于分子標記技術的刀鱭林氏異鉤鋏蟲的檢測及驅除方法，其特征在于，模板DNA的制備方法為：

從-20℃的95％的酒精保存液取出取出中體，置于2ml無菌離心管中，無菌水清洗并放置4℃冰箱置換過夜；

再次清洗并QIAGEN?QIAamp?DNA?Mi?ni?Kit試劑盒進行DNA的提取，最后定容置25μL無菌水中，-20℃保存。

6.如權利要求2所述的基于分子標記技術的刀鱭林氏異鉤鋏蟲的檢測及驅除方法，其特征在于，pcr擴增及擴增片段克隆方法為：

以

CD1：(GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT)

和CD2-(TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT)

為引物擴增林氏異鉤鋏蟲28S序列引物；以4ul寄生蟲DNA為模板，NC5和NC2為引物擴增ITS片段；反應體系為50μL，反應條件為95℃預變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，循環35次；同樣以4μL寄生蟲DNA為模板，CD1和CD2為引物擴增28S片段；反應體系為50μL，反應條件為95℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，循環35次；擴增產物經1％濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測分析；

將剩余PCR產物跑回收膠并用DNA凝膠回收試劑盒純化，以純化產物為模版，對28S片段大量擴增，與pMD18-T載體相連進行TA克隆，篩選陽性克隆子提質粒進行測序。