[發明專利]一種由根癌農桿菌介導的絲狀真菌基因RNA干擾方法

有效

• 申請號: 201310047843.2
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103088047A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 張振穎;侯彬彬;劉曉明
• 申請（專利權）人: 張振穎;侯彬彬;劉曉明
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N1/21;C12N1/14;C12R1/01;C12R1/645
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

1.一種重組載體PCB309-pfgrt，其堿基序列為SEQ?ID?NO.21。

2.如權利要求1所述的一種轉染重組載體PCB309-pfgrt的根癌農桿菌。

3.如權利要求2所述的轉染重組載體PCB309-pfgrt的根癌農桿菌，其特征在于，所述的根癌農桿菌為根癌農桿菌EHA105。

4.根據權利要求3所述的轉染重組載體PCB309-pfgrt的根癌農桿菌，其特征在于，其通過以下方法制備：

(a)將重組載體PCB309-pfgrt采用電擊的方法轉化根癌農桿菌EHA105感受態細胞；再用含有抗生素Kan50mg/ml和利福平25mg/的LB培養基篩選陽性克??；

(b)用引物SEQ?ID?NO.9和10對步驟（a）篩選的陽性克隆進行PCR鑒定。

5.根據權利要求4所述的轉染重組載體PCB309-pfgrt的根癌農桿菌，其特征在于，所述的PCR鑒定條件為：94℃預變性1min；94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30個循環；72℃10min。

6.一種絲狀真菌基因RNA干擾方法，其特征在于，包括以下步驟：

①如權利要求3所述的轉染重組載體PCB309-pfgrt的根癌農桿菌與真菌細胞混合后，涂布于含200μmol/L的乙酰丁香酮的誘導培養基平板，25℃避光培養48h；

②將步驟①獲得的菌落轉移到篩選培養基平板上培養4天，收集生長的陽性菌落接種于沙氏培養基，4℃保存；

其中，所述的誘導培養基平板為：瓊脂15g/L,K-緩沖液8ml/L,Mn緩沖液20ml/L,1%CaCl₂.2H₂O1ml/L,0.01%FeSO₄10ml/L,微量元素5ml/L，20%NH₄NO₃2.5ml/L,50%甘油10ml/L1M?MES40ml/L，20%葡萄糖10ml/L。篩選培養基平板：誘導培養基平板中加入100mg/L潮霉素，200uM頭孢噻肟鈉。

7.根據權利要求6所述的絲狀真菌基因RNA干擾方法，其特征在于，所述的真菌細胞為絲狀真菌。

8.根據權利要求7所述的絲狀真菌基因RNA干擾方法，其特征在于，所述的絲狀真菌為申克孢子絲菌或犬小孢子菌。