[發明專利]25羥維生素D檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201310045644.8
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103163306A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 劉鶴;張小銳;蔡華雅;劉希
• 申請（專利權）人: 北京九強生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82;G01N33/531
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

技術領域

本發明涉及臨床體外診斷及醫學免疫學領域；具體地涉及一種免疫檢測試劑；更進一步地，本發明涉及一種25羥維生素D檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

維生素D也稱抗佝僂病維生素，又可分為維生素D2和維生素D3。維生素D2多含于植物性食物中，它是由植物的麥角固醇經陽光照射而合成的，維生素D3可由人體皮膚和脂肪組織在7-脫氫膽固醇經過陽光照射合成。維生素D2屬脂溶性維生素，來自食物中的維生素D與脂肪一起經小腸吸收，在膽汁協助下形成乳糜微粒，由淋巴管進入血液，與自身合成的維生素D3一起轉運入肝臟。在肝臟中經肝細胞微粒體中的單氧酶系統（25-羥化酶）的作用，形成25羥維生素D。25羥維生素D在腎近端小管上皮細胞線粒體內α羥化酶系統的作用下轉變為1,25(OH)₂D3，它是維生素D最大的生物作用形式，可以促進腸道鈣結合蛋白的合成。而25羥維生素D是代謝中的主要循環形式，能夠反映機體的維生素D水平。

維生素D缺乏又稱維生素D缺乏性佝僂病。常見于嬰幼兒，多見于膳食中缺乏維生素D，或者是人體缺乏陽光的照射。由于體內維生素D不足而引起鈣、磷代謝障礙，鈣鹽不能正常地沉積于骨骼的生長部分，以致出現生長骨發生病變為特征的一種慢性營養性疾病，稱為佝僂病。如果該病發生于成人，則出現發育成熟骨骼的鈣化不全，稱為骨軟化癥。研究還表明，維生素D缺乏可能使某些癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的發病風險升高。

根據當前糖尿病報告雜志上發表的結果，3,262例年齡50-70歲之間的中國人參加的一項研究表明94％的人維生素D缺乏或不足，這些人中有42％還有代謝綜合征。其它一些研究表明，維生素D缺乏和不足在中國的孕婦以及6-16歲的兒童中也很常見。而長期攝入過多的維生素D（5000IU），將引起高血鈣和高尿鈣。特征為食欲減退，過度口渴、惡心、嘔吐、煩躁、體弱、便泌腹瀉交替出現，嚴重者將因腎鈣化、心臟和大動脈鈣化而死亡。隨著醫療專業人員和患者意識到維生素D缺乏的潛在健康風險，實驗室檢驗量激增，需要我們提供更快、更準、更有效的檢測方法，幫助醫生和患者更早的得到檢測結果。

目前25羥維生素D的測定方法主要有酶聯免疫法（如CN102628872A中公開的方法和試劑盒，以及DRG提供的25-OH維他命D（總）檢測試劑盒EIA5396）、放射免疫法（如Hollis?BW等人，1985）、液相色譜-質譜檢測法（如鄭曉艷等人，2012）以及化學發光法（如單詠梅等人，2011；索靈生產的25-羥基總維生素D定量測定試劑盒（化學發光法））。酶聯免疫法自動化程度不高，且受人為因素影響較大。放射免疫法存在著環境污染問題；液相色譜質譜操作復雜，用時較長；而化學發光法靈敏度雖高，但檢測成本較高，需要特定化學發光儀，這些原因導致其應用范圍較小。

本發明采用膠乳增強免疫透射比濁法測定人樣本中25羥維生素D濃度，該方法對儀器設備要求不高，沒有環保和操作人員自身防護等問題。而目前市場上還未出現膠乳增強免疫透射比濁法測定人樣本中25羥維生素D濃度的試劑盒，與其它測定方法比較，本方法簡便快速、靈敏可靠，普通自動或半自動生化分析儀就可，有較大應用范圍和實用價值。

發明內容

根據本發明的第一方面，提供了一種25羥維生素D檢測試劑盒，其包含第一試劑，和第二試劑。第一試劑包含25羥維生素D抗體、維生素D結合蛋白抗體和緩沖液，第二試劑包含結合有25羥維生素D抗原的微球和緩沖液。在一些實施方式中，第一試劑和第二試劑中的緩沖液選自磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、硼酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液或氯化銨緩沖液中的一種或幾種；緩沖液濃度為10-500mM。

在一些實施方式中，第一試劑和第二試劑中的緩沖液類型可以相同也可以不同；第一試劑和第二試劑中的緩沖液濃度可以相同也可以不同。

在一些優選實施方式中，第一試劑和第二試劑中的緩沖液類型相同；第一試劑和第二試劑中的緩沖液濃度不同。

在一個具體實施方式中，第一試劑的緩沖液是50mM?MES緩沖液；第二試劑的緩沖液是20mM?MES緩沖液。本領域技術人員可以理解，隨著緩沖液類型、濃度等因素的改變，緩沖液的pH值可以有所不同。

在一些實施方式中，25羥維生素D抗體為多克隆抗體或單克隆抗體；維生素D結合蛋白抗體為多克隆抗體或單克隆抗體；其中多克隆抗體源自兔、羊或雞，單克隆抗體源自鼠或兔。

在一些實施方式中，所述25羥維生素D抗原為自然抗原或人工合成抗原。