[發明專利]超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法

無效

• 申請號: 201310042001.8
• 申請日: 2013-01-27
• 公開（公告）號: CN103172733A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 詹麗娥;劉華棟;陸冰洋;王采先;唐娟;詹海杰
• 申請（專利權）人: 山西省農科院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.超強毒傳染性法氏囊病毒vvIBDV高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采集不同地區、不同雞場疑似傳染性法氏囊病雞病料，進行病原的分離培養、設計一對引物擴增傳染性法氏囊病毒vp2基因序列、由于vp2屬于其特征性保守序列，能擴增出這段序列即能對其鑒定，利用擴增出來的產物經過電泳、觀察，確保擴增出與設計的目的條帶大小相符的條帶，對含有擴增產物的瓊脂糖凝膠回收，測序，同國際和國內已發表的已知序列比對，即可對其分型，分為超強毒毒株、強毒毒株、普通毒株等，最終確定本次分離到的傳染性法氏囊病毒毒株屬于超超強毒株。

2.如權利要求1所述的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括病料采集處理及病毒純化繁殖，vvIBDV-PCR鑒定，步驟如下：

病料的采集處理：從不同地區疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料；主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀；將法氏囊反復凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，無菌研磨，再加等體積加入4000IU青霉素、2000IU鏈霉素/ml的雙抗，放入-20℃保存，備用；用瓊脂擴散試驗檢測病毒效價，被檢病毒與標準法氏囊陽性血清出現明顯的沉淀線，證明法氏囊病毒的存在；

病毒純化繁殖：法氏囊病毒乳液在雞胚中繁殖：購買60枚PFS雞蛋，分三批孵育，每批20枚；將第一批20枚雞蛋放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度；4日后放入第二批，再4日后放入第三批；當第一批雞胚10日齡時，雞胚絨毛膜接種法氏囊病毒，0.2ml/枚，接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，逐日觀察，24h內死亡胚棄去，48h死胚保留，120h死活胚從孵化器中取出，放入4℃冰箱靜置，收獲內死、活雞胚絨毛膜和尿囊液；采用瓊脂擴散試驗方式測法氏囊病毒效價，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，效價為2¹；將胚體和絨毛膜無菌取出加PBS緩沖液充分研磨，反復凍融3次后，進行第二次接毒，方法同上，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，病毒效價為2³；同樣進行第三次接病毒，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，病毒效價為2⁶。

3.如權利要求1所述的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法包括vvIBDV-PCR鑒定，步驟如下：

引物的設計與合成：根據genbank登錄IBDV?vp2基因參考序列和表達載質粒pFastBacHTA表達閱讀框設計vp2基因擴增引物：

P1：5′-CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3′；

P2：5′-CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3′；

兩頭分別引入EcoRI和XhoI酶切位點；

病毒RNA的提取：用Trizol法提取RNA，取250ul病毒液于一普通的1.5ml?EP管中，加入750ul?Trizol，震蕩混勻，靜置5min；加入150ul氯仿，震蕩混勻，4℃離心，12000r/min，5min；取上清加入450ul異丙醇，顛倒混勻，4℃離心，12000r/min，12min；棄液體，加1ml75％DEPC乙醇洗滌，4℃離心，12000r/min，5min；棄液體，虹吸，干燥沉淀；加9ulDEPC水、，50℃水浴10min，開始反轉錄；反轉錄步驟為：10ulRNA、1ul隨機引物和4uldNTP混勻，65℃水浴8min后迅速冰浴5min；再加入4ul?Buffer、1ul反轉錄酶和1ul?lulRNase?inhibitor，37℃水浴2-3h；以反轉錄產物為模板，，P1和P2為引物進行PCR反應；PCR反應體系：5×Star?Buffer5ul，dNTP2ul，4ul模板，P1和P2各0.5ul，Primestar0.25ul，ddH₂O12.75ul；PCR反應條件：98℃預變性10s；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸100s共30個循環，72℃終延伸10min；凝膠電泳以鑒定分子量大小；將PCR產物按照AxyPrep?DNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收；取4.5ul回收產物加入5ul?Sollution?I和0.5ulVenter，混勻，4℃過夜；將連接產物轉化入E.coliDH5α感受態細菌，涂布在用LB配制的1.5％瓊脂平皿上，含氨芐青霉素100mg/L，37℃培養14h；挑單菌落接種入含氨芐青霉素100mg/L的LB()，振搖培養12h；提取質粒；質粒用EcoR?I和Xho?I雙酶切鑒定，陽性重組質粒命名為T-VP2；

分離株VP2序列分析及推導氨基酸序列分析：測序結果表明，分離株VP2基因核苷酸長度為1389bp，推導氨基酸序列含有347個氨基酸，采用DNAs?tar軟件對測序結果進行分析，對照IBDV經典強、弱毒株及超超強毒株高變區氨基酸序列分析分離株VP2分子特征；分離株符合強度株的特征：分離株VP2第328-334位氨基酸序列為S-W-S-A-S-G-S，這與IBDV經典超強毒株VP2七肽區序列相同，超超強毒分子特征為222A、256I、294I和299S本分離株符合256I、294I和299S三個特征，證明本毒株為vvIBDV經典超強毒株。