[發明專利]一種基于受激發射損耗的超分辨熒光壽命成像方法和裝置

有效

• 申請號: 201310039978.4
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103163106A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 葛劍虹;蔡歡慶;匡翠方;劉旭
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于熒光壽命成像領域，特別涉及一種基于受激發射損耗的在超分辨下長距離探測熒光壽命成像的方法和裝置。

背景技術

熒光是分子吸收能量后其基態電子被激發到激發態后由激發態回到基態時所發生的。而熒光壽命是指分子受到光脈沖激發后返回基態之前在激發態平均停留的時間，熒光物質的熒光壽命一般來說是絕對的，不受激發光強度、熒光團強度和光漂白等因素的影響，而僅和細胞自身的結構和其所處的微環境有關。因此，測量樣品熒光壽命的熒光壽命成像顯微術(FLIM)，可以提供諸多重要的生物信息，比如細胞質基質粘度，pH值，細胞代謝等。

測量熒光壽命的方法主要有時域法，頻域法和泵浦探測法。時域法是用超短脈沖光激發樣品，測量樣品在光脈沖激發后熒光強度的衰減規律，最后根據所測得的樣品中各點的熒光強度衰減曲線來擬合分析并計算熒光壽命值。頻域法是用強度按正弦規律調制的激光激發樣品，熒光強度按正弦調制，且兩者調制頻率相同，通過測量熒光相對于激發光的相位差及解調系數來計算熒光壽命值。然而無論是時域法還是頻域法都是分析樣品自發輻射所產生的熒光，由于其方向的不確定性，因此需要較高數值孔徑的光學系統以便有效的收集熒光信號。而泵浦探測方法則是在一束激光激發樣品的同時用另一束激光照射，收集樣品通過受激發射作用所產生的熒光，由于其具有高方向性，因此不會受限于光學系統的數值孔徑和工作距離。

然而，受光學衍射極限的限制，傳統熒光壽命成像方法的空間分辨率只有200納米左右，難以滿足科學研究的需要。本發明在泵浦探測法的基礎上提出了一種基于受激發射損耗的熒光壽命成像方法和裝置，實現了在超分辨下長距離探測熒光壽命。

發明內容

本發明提供了一種基于受激發射損耗的超分辨熒光壽命成像方法和裝置，裝置結構簡單，易于操作，熒光壽命成像系統的空間分辨率和信噪比顯著改善，實現了超分辨下長距離探測熒光壽命，可用于光學顯微領域以及高通量生化分析，組織鑒別，胞內生理學等領域。

一種基于受激發射損耗的超分辨熒光壽命成像方法，包括以下幾個步驟：

1)將第一激光光束投射到待測樣品上，待測樣品中的粒子由基態激活至激發態；

2)用STED光投射到待測樣品上，消耗步驟1)中處于激發態的粒子的數量；

3)將第二激光光束投射到熒光樣品上，激發剩余的處于激發態的粒子發出熒光，并收集所述熒光得到相應的熒光強度圖像；

4)第二激光光束和STED光之間設有延遲，改變延遲時間，重復步驟3)，得到不同延遲時間下的熒光強度圖像；

5)通過計算機對不同延遲時間下的熒光強度圖像進行處理，并擬合光點強度衰減規律，反演壽命圖像，完成對待測樣品一點的掃描；

6)通過改變第一激光光束、STED光和第二激光光束聚焦到待測樣品上的位置，完成對待測樣品的二維掃描。

本發明的待測樣品可以為熒光樣品，也可以為非熒光樣品；待測樣品為熒光樣品時，熒光樣品中的熒光染料分子在激光作用下發出熒光，若待測樣品為非熒光樣品，非熒光樣品中的粒子在第一激光光束的作用下由基態躍遷至激發態，處于激發態的粒子在第二激光光束的作用下發出熒光。

第一激光光束、STED光、和第二激光光束并不是同時入射到待測樣品上，第一激光光束和STED光以及STED光和第二激光光束之間均設有延遲時間。

通過改變光束投射到待測樣品中的位置來完成對待測樣品的二維掃描。可以將待測樣品放置在納米平移臺上通過計算機控制納米平移臺在垂直光軸面移動，完成對待測樣品的二維掃描；還可以在光源和樣品之間設置二維掃描振鏡，通過改變激光在待測樣品上的聚焦位置，來完成對待測樣品的二維掃描。

所述第一激光光束和第二激光光束投射在待測樣品上形成大小相同的圓形光斑，所述STED光投射到待測樣品上形成環形光斑，且圓形光斑和環形光斑的中心重合。STED光用于減少處于激發態的粒子的數量，減小待測樣品的發光熒光的衍射面積，提高熒光壽命成像的分辨率。

本發明還提供了一種用于實施上述超分辨熒光壽命成像方法的裝置，包括：

分別用于發出第一激光光束、STED光和第一激光光束的第一光源、第二光源和第三光源；

用于放置待測樣品的樣品臺；

用于收集待測樣品發出熒光的光強信息圖像的探測器；

以及用于對所述光強信息圖像進行處理分析的計算機。

設有用于將第一光源、第二光源和第三光源發出的光束聚焦到待測樣品上的第一物鏡，以及用于收集待測樣品發出熒光的第二物鏡。