[發(fā)明專利]一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導(dǎo)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310039710.0
• 申請(qǐng)日: 2013-01-31
• 公開（公告）號(hào): CN103960175A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尤鋒;吳志昊;胡金偉;馬得友;譚訓(xùn)剛;張培軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
• 主分類號(hào): A01K61/00
• 分類號(hào): A01K61/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及染色體操作技術(shù)，具體地說是一種利用靜水壓力抑制受精卵卵裂的原理，批量誘導(dǎo)大菱鲆四倍體魚苗的方法。

背景技術(shù)

大菱鲆（Scophthalmus maximus）屬于菱鲆科（Scophthalmidae）、菱鲆屬（Scophthalmus），其生長(zhǎng)快，目前已經(jīng)成為我國(guó)北方主要的海水養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖工藝和產(chǎn)業(yè)鏈也相對(duì)完善。但是，近年來大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)由于累代養(yǎng)殖和近親交配，造成種質(zhì)嚴(yán)重退化。因此采取有效方法，對(duì)大菱鲆進(jìn)行遺傳改良，從根本上解決大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)良種化問題已成當(dāng)務(wù)之急。多倍體因其周期短、見效快和安全性高等特點(diǎn)，一直受到研究者和養(yǎng)殖業(yè)者的關(guān)注。其中，三倍體魚具有三套染色體，往往是不育的。不育三倍體生物將用于繁殖的能量轉(zhuǎn)化到生長(zhǎng)方面，表現(xiàn)出生長(zhǎng)快、個(gè)體大、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。所以，三倍體的人工誘導(dǎo)和培育將會(huì)是大菱鲆良種培育不可缺少的有效途徑。但魚類三倍體人工誘導(dǎo)一般采用溫度休克或者靜水壓等方法抑制受精卵第二極體排放的方式獲得，且每代均需人工受精并進(jìn)行誘導(dǎo)，操作步驟相對(duì)繁瑣；人工受精和誘導(dǎo)也對(duì)受精卵有刺激作用，造成受精率和孵化率偏低，從而影響了其生產(chǎn)推廣。而如果誘導(dǎo)獲得了四倍體大菱鲆，則可通過四倍體與二倍體雜交的方式，一勞永逸進(jìn)行三倍體育種。因此，開展大菱鲆四倍體誘導(dǎo)和培育研究，對(duì)于大菱鲆良種培育及其養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展是非常必要的；同時(shí)，也可以為其他魚類四倍體人工誘導(dǎo)方法的優(yōu)化提供有益參考。

人工誘導(dǎo)海水魚類四倍體常采用靜水壓或溫度休克抑制卵裂獲得，由于溫度休克特別是冷休克處理時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)受精卵刺激較大，休克溫度也不易保持穩(wěn)定，誘導(dǎo)四倍體的效率以及成活率往往較低。而靜水壓法處理時(shí)間較短，對(duì)受精卵的刺激相對(duì)較小，更容易生產(chǎn)應(yīng)用。靜水壓法誘導(dǎo)的成功率主要受處理時(shí)刻（處理起始的時(shí)間）、處理壓力和處理時(shí)間（處理延續(xù)的時(shí)間）三個(gè)因素的影響，其中處理時(shí)刻是起決定作用的因素。因此，準(zhǔn)確的確定處理時(shí)刻是魚類四倍體誘導(dǎo)成功與否，以及能否獲得較高誘導(dǎo)率的關(guān)鍵。目前，人工誘導(dǎo)四倍體在魚類尤其是純海水魚類中應(yīng)用還幾乎沒有。鲆鰈魚類中僅在半滑舌鰨、牙鲆等中有過一些嘗試性的研究，而在大菱鲆中尚未見報(bào)道。由于不同魚種最適的處理?xiàng)l件往往會(huì)有很大的差別，因此，對(duì)大菱鲆四倍體誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化和明確是十分重要的。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)以往四倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中處理時(shí)刻無法準(zhǔn)確確定而影響誘導(dǎo)效率的情況，本發(fā)明目的在于提供一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導(dǎo)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導(dǎo)方法，

1）大菱鲆人工受精：

選擇性成熟的大菱鲆親魚，分別收集精液和卵，待用；

取上述少量精液，用少許新鮮海水激活后，迅速與卵子按體積比1:100-200混合均勻，隨后補(bǔ)入卵子體積1-5倍量的新鮮海水進(jìn)行授精，授精后將受精卵用新鮮海水沖洗干凈，置于卵子體積5-10倍量的新鮮海水中培育，培育期間再補(bǔ)入卵子體積10-15倍量的新鮮海水，作為對(duì)照組；

待對(duì)照組人工受精15～-25min后，將上述采集的剩余精液，用少許新鮮海水激活后，迅速與卵子按體積比1:100-200混合均勻，隨后補(bǔ)入卵子體積1-5倍量的新鮮海水進(jìn)行授精，授精后將受精卵用新鮮海水沖洗干凈，置于卵子體積5-10倍量的新鮮海水中培育，培育期間再補(bǔ)入卵子體積10-15倍量的新鮮海水，作為誘導(dǎo)組；

2）染色體誘導(dǎo)加倍

以對(duì)照組70-80％受精卵出現(xiàn)第一次卵裂痕的時(shí)間作為誘導(dǎo)組受精卵出現(xiàn)第一次卵裂痕的時(shí)間，在誘導(dǎo)組第一次卵裂痕出現(xiàn)前10-20min，將步驟1）誘導(dǎo)組受精卵置于靜水壓機(jī)加壓容器內(nèi)，在60-70MPa靜水壓下進(jìn)行壓力休克處理，處理6-8min后泄壓，取出受精卵，置于海水中繼續(xù)培育；

3）原腸胚和魚苗四倍體率的測(cè)定：將誘導(dǎo)組的原腸胚進(jìn)行染色體的倍性鑒定，并對(duì)孵化出的魚苗進(jìn)行流式細(xì)胞儀DNA含量的倍性鑒定，獲得大菱鲆原腸胚期和魚苗期四倍體率。

所述步驟1）和步驟2）中受精時(shí)期、孵育時(shí)期以及誘導(dǎo)時(shí)期三個(gè)時(shí)期所用海水的溫度為13-18℃之間任意恒定的適宜大菱鲆卵生長(zhǎng)所需水溫；其中三個(gè)時(shí)期所用的海水溫度應(yīng)保持一致，且溫差在±0.1℃以內(nèi)。

所述將步驟1）誘導(dǎo)組受精卵置于靜水壓機(jī)加壓容器內(nèi)的時(shí)間為誘導(dǎo)組處理前1min左右。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下：