[發明專利]膽固醇修飾的生物可降解聚陽離子載體及制備方法和用途

有效

• 申請號: 201310038621.4
• 申請日: 2013-01-31
• 公開（公告）號: CN103110954A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 王堅成;張強;陳成軍;高玲燕
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: A61K47/34
• 分類號: A61K47/34;A61K48/00;A61K45/00;A61K38/00;C08G73/02
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所 11130
• 代理人: 王為

技術領域

本發明涉及一種非病毒藥物載體材料。特別涉及膽固醇修飾的生物可降解聚陽離子載體及制備方法和用途，具體是由平均分子量2kD-20kD的功能化線性聚（酰胺-胺）與膽固醇通過酰胺鍵或酯鍵化學偶聯形成功能化線性聚（酰胺-胺）-膽固醇梳狀嫁接物，臨界膠團濃度>1mg/L，可在水相介質中自組裝形成納米顆粒，粒徑介于20-200nm，納米顆粒表面帶正電荷，膽固醇接枝率為10％-90％。該納米顆粒可用于包載化學藥物、基因藥物和多肽蛋白藥物遞送。

技術背景

基因輸送的成功依賴于安全有效的輸送載體。輸送載體包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體具有轉染率高的優點，但其因載藥量低、不易工業大規模生產、細胞特異性差、存在免疫原性等缺點限制了其在基因輸送系統的應用前景。同時，病毒載體輸送基因治療導致嬰兒免疫缺陷的臨床病例已有報道（Nature,427,779-781，2004），這引起嚴重的臨床用藥安全的顧慮。病毒載體的這一缺陷也間接地推動了非病毒載體的發展。

非病毒載體一般包括，陽離子脂質體、陽離子聚合物、無機陽離子載體等。在陽離子聚合物載體中，目前常用的有聚乙烯亞胺（PEI）、樹狀大分子、聚賴氨酸（PLL）和殼聚糖等材料。

基因藥物(如質粒DNA，siRNA等)通常具有分子量大、親水性強、荷負電且易于被核酸酶降解破壞的性質，在實際應用中，裸基因藥物通常表現出較低的細胞轉染能力和非常差的基因治療效果。通常需要與陽離子材料形成納米級的靜電復合物，從而使其具有較好的細胞攝取能力、較高的穩定性以及較好的基因治療效應。

近年來，許多科學家致力于具有非免疫原性的陽離子聚合物類非病毒基因載體研究。這些聚合物多為通過化學合成的多氨基結構，包括聚氨基酸和多聚乙烯亞胺等。聚乙烯亞胺（PEI）作為輸送載體廣泛地應用于pDNA，siRNA，ODN等基因的遞送。由于其強正電性能夠高效的壓縮siRNA，形成納米級的靜電復合物。其多氨基結構（伯胺25％，仲胺50％，叔胺25％）產生的“質子海綿效應”能夠使復合物逃逸溶酶體的降解，所以PEI被稱作是基因輸送載體的“金標準”。然而，這些載體材料的主要問題是低濃度時轉染效率低，而高濃度時存在明顯的細胞毒性，這一缺點限制其在體內外的廣泛應用。

具有氨基結構、安全低毒，并具有體內抗核酶作用的聚陽離子可生物降解材料最近頗受人們關注，國內外研究人員已開展了很多創新載體的設計。很多研究表明含有二硫鍵(s-s)的聚胺化合物因其在細胞內還原性環境二硫鍵容易斷裂，有利于靜電復合物的解組裝，從而更好地在細胞漿中釋放基因藥物，由此產生較高的基因輸送效率。另外含二硫鍵(s-s)的聚合物具有可生物降解、生物相容性好、細胞毒性低，并具有氧化-還原敏感釋放基因藥物的優勢。我們課題組也曾合成并利用含二硫鍵聚酰胺-胺材料來包載和遞送siRNA，研究顯示這種材料具有良好的氧化還原酶敏感性，在細胞毒性和siRNA包載保護效應等方面，具有其獨特的優勢，但轉染效率不高的問題依然存在[Int?J?Nanomedicine2012；7：3837-49]。

膽固醇是一種內源性生理物質，具有良好的生物相容性，近年來，有很多學者利用膽固醇化學偶聯與親水性聚合物鏈段形成兩親性載體材料，并可在水溶液中自組裝形成納米顆粒。如膽固醇修飾的聚乙烯亞胺（PEI2kD）因為形成穩定的膠束而提高載體的細胞攝取，在pDNA的輸送系統中取得很高的輸送效率（JControl?Release2007；118：357-63）。也有學者報道通過形成季銨鹽的方式將膽固醇接枝于陽離子載體也能取得了良好的基因輸送效率（Biomaterials2007；2835：5358-68）。這些已報道的兩親性載體材料中，親水聚合鏈片段多為生物不可降解材料，盡管采用膽固醇修飾，但在利用這些材料遞送基因藥物時仍然表現出轉染效率不高且具有較大毒性的問題。

發明內容

本發明提供了膽固醇修飾的生物可降解聚陽離子載體的制備方法及其用途。本發明的載體，是由平均分子量2kD-20kD的功能化線性聚（酰胺-胺）與膽固醇通過酰胺鍵或酯鍵化學偶聯形成的。

其中所述線性聚（酰胺-胺）是由N，N′-雙(丙稀酰)胱胺（cystamine?bisacrylamide，CBA)）與含-NH₂單體通過邁克爾加成（Michael?addition）反應聚合形成的具有重復單元的線性聚合物，且聚合物中每個單元結構中均含有二硫鍵。該聚合物屬于現有技術，其結構如下：