[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)水稻黑條矮縮病毒的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310037121.9
• 申請(qǐng)日: 2013-01-31
• 公開（公告）號(hào): CN103103292A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐秋芳;周益軍;周彤;季英華;程兆榜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種快速檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)水稻黑條矮縮病毒的方法，包括以下步驟：

(1)灰飛虱在-20℃冷凍5min，取出單頭灰飛虱裝入0.2mL離心管，加入100μL的無菌水清洗灰飛虱，清洗2次后加入30μL?DEPC水，用無菌牙簽搗碎蟲體，10000g離心1min，取上清。

(2)以離心后獲得的上清液為模板，用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄方法為：在0.2mL離心管內(nèi)加入9.5μL上清液和1μL隨機(jī)引物Random6。70℃放置5min后立即取出置于冰上放置1min，依次加入5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液3μL、dNTPs(10mM/dNTP)0.5μL、RNase?inhibitor(20U/μL)0.5μL、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)0.5μL，42℃放置1h，70℃保溫5min。

(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用RBSDV病毒的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，若PCR能擴(kuò)增到與預(yù)期大小一致的電泳條帶則表明單頭灰飛虱中含有RBSDV。RBSDV病毒的特異性引物可根據(jù)NCBI中已登錄的RBSDV的基因組S1～S10序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。PCR方法為：在0.2mL的離心管中分別加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5.0μL，10×PCR緩沖液2.5μL，10mM/dNTP0.5μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，5U/μL?TaqDNA聚合酶0.5μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸1min，35～40個(gè)循環(huán)；72℃延長10min。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在于不需要提取灰飛虱RNA，通過搗碎的方法使灰飛虱細(xì)胞內(nèi)的RNA包括病毒的RNA釋放出來，離心獲得適用于檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)水稻黑條矮縮病毒的上清液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在于用上清液作為模板，用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得適用于PCR檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的cDNA模板。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)為35～40次。