[發(fā)明專利]一種Micro RNA表達檢測方法及其定量檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310036690.1
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103205489A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姚遠颋;王海峰;費倩嵐;談竹君;勞昕元
• 申請（專利權(quán)）人: 上海黃離生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

1.一種Micro?RNA表達檢測方法，其特征在于，所述Micro?RNA表達檢測方法包括以下步驟：

（1）提取樣品的Micro?RNA，將所得Micro?RNA連接PolyA尾巴；

（2）將三條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物混合后進行退火處理，所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列分別如序列表中SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2和SEQ?IDNO:3所示；

（3）將步驟（1）所得連有Poly?A尾巴的Micro?RNA與步驟（2）所得具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物退火連接；

（4）以步驟（3）所得Micro?RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

（5）以步驟（4）所得cDNA為模板，加入擴增目標Micro?RNA的引物，通過熒光定量PCR方法檢測目標Micro?RNA的表達。

2.如權(quán)利要求1所述的Micro?RNA表達檢測方法，其特征在于，步驟（2）所述退火處理的程序為：（1）95℃反應(yīng)2min，（2）每5～10秒下降0.1℃，降至35℃～15℃，（3）4℃保存。

3.如權(quán)利要求1所述的Micro?RNA表達檢測方法，其特征在于，步驟（3）所述退火連接的程序為：60～70℃，反應(yīng)5～10min。

4.如權(quán)利要求1所述的Micro?RNA表達檢測方法，其特征在于，步驟（4）所述反轉(zhuǎn)錄的程序為：（1）30℃反應(yīng)10～15分鐘；（2）42℃反應(yīng)50～60分鐘；（3）50℃反應(yīng)10～15分鐘；（4）95℃反應(yīng)10～15分鐘；（5）將所得cDNA樣品于4℃保存。

5.如權(quán)利要求1所述的Micro?RNA表達檢測方法，其特征在于，步驟（5）所述擴增目標Micro?RNA的引物為：Micro?RNA通用反向引物和MicroRNA檢測正向引物，所述Micro?RNA檢測正向引物的序列如序列表中SEQID?NO:5所示。

6.一種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，其特征在于，所述具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:3所示。

7.一種Micro?RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，該Micro?RNA定量檢測試劑盒包括：SYBR?Green?I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水、具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物、通用反向引物和Micro?RNA檢測正向引物，其中所述具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物的序列分別如序列表中SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3所示。

8.如權(quán)利要求7所述的Micro?RNA定量檢測試劑盒，其特征在于，所述Micro?RNA檢測正向引物的序列如序列表中SEQ?ID?NO:5所示。

9.權(quán)利要求7～8任一項所述Micro?RNA定量檢測試劑盒在檢測Micro?RNA表達中的應(yīng)用。