[發(fā)明專利]煙草中核黃素的分析鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310033478.X
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號(hào): CN103115980A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃翼飛;胡靜
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及卷煙檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種煙草中的核黃素的分析鑒定方法，尤其涉及采用液相色譜-電噴霧線性離子阱多級(jí)質(zhì)譜分析方法分析鑒定煙草中的核黃素。

背景技術(shù)

核黃素，即維生素B₂，是一種水溶性化合物。核黃素具有多種生物學(xué)和生理學(xué)功能，是維持人體健康不可缺少的微量營養(yǎng)素，例如，缺乏核黃素會(huì)引起口腔發(fā)炎、舌炎、角膜發(fā)炎等。煙草中的核黃素早在50年代末被發(fā)現(xiàn)，核黃素在煙草相關(guān)領(lǐng)域的研究引起不少學(xué)者和研究機(jī)構(gòu)的關(guān)注，它可作為體內(nèi)抗氧化劑，有利于阻止煙氣中的硝酸鹽的轉(zhuǎn)化，也可作為體內(nèi)感光劑進(jìn)行抗體催化氧化降解尼古丁。

近期劉菲等用核黃素處理煙草懸浮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，核黃素處理后提高了煙草懸浮細(xì)胞PAL、POD?活性，積累了更多與抗病有關(guān)的次生代謝產(chǎn)物。

因?yàn)闊煵葜泻它S素含量較低，對于煙草樣品中本身存在的核黃素的儀器分析鑒定方法一直以來卻沒有報(bào)道，更未見煙草樣品中核黃素的定量檢測報(bào)道。

液相色譜是分析核黃素的常用方法，但將液相色譜法其應(yīng)用于煙草樣品時(shí)，因?yàn)闊煵葜泻它S素含量低，且煙草樣品基質(zhì)復(fù)雜，需要進(jìn)行繁雜的樣品前處理，且可能存在共流出現(xiàn)象。近些年來，隨著液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）的不斷成熟與普及，LC-MS在定性定量分析中都得到了相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。Leporati等用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析了多種水溶性維生素，但三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜只能在二級(jí)質(zhì)譜水平上獲取離子碎片信息，定性分析能力有限。

隨著煙草質(zhì)量和消費(fèi)要求的不斷提高，滿足煙草制品的質(zhì)量、產(chǎn)品研究需要，建立靈敏、準(zhǔn)確、快速鑒定煙草中核黃素的方法已經(jīng)成為本技術(shù)領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

?本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有核黃素分析檢測技術(shù)的不足，尤其是煙草樣品中核黃素分析鑒定技術(shù)的不足，提供一種煙草中核黃素的定性分析鑒定方法，本發(fā)明采用液相色譜-電噴霧線性離子阱多級(jí)質(zhì)譜分析鑒定煙草中是否含有核黃素。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

提供一種煙草中核黃素的分析鑒定方法，是采用液相色譜-電噴霧線性離子阱多級(jí)質(zhì)譜法獲取煙草樣品核黃素的色譜圖，包括以下步驟：

S1.樣品液準(zhǔn)備；

稱取0.25?g?煙末，加入25?mL?0.1?mol/L?鹽酸后在95℃水浴中搖蕩1小時(shí)，冷卻后加入20?mL?2?mol/L醋酸銨，用水定容至50?mL即得待測煙草樣品溶液，以待測煙草樣品溶液制備不同濃度梯度的進(jìn)樣液；?

配制核黃素的甲醇溶液作為儲(chǔ)備液，避光保存在2℃下；配制核黃素的水溶液作為工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，核黃素的濃度為4μg核黃素/mL水。

S2.將進(jìn)樣液經(jīng)0.2?μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣，采用液相色譜-電噴霧線性離子阱多級(jí)質(zhì)譜法進(jìn)行分析檢測；

液相色譜條件為：

安捷倫Eclipse?XDB-C₁₈?column?(50?mm?×?2.1?mm,?1.8?μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇?:?0.1%甲酸?=?40%?:?60%（體積比），所述甲酸的濃度0.1%為體積百分比濃度；使用安捷倫Zorbax?C₁₈保護(hù)柱?(12.5?mm?×?2.1?mm，5?μm)，等梯度淋洗，流速200?μL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣環(huán)5μL，全環(huán)進(jìn)樣。

電噴霧線性離子阱多級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)譜條件為：

毛細(xì)管溫度：350℃；噴霧電壓：5?kV；鞘氣：31?LTQ單位；輔助氣：5?LTQ單位；最大離子注射時(shí)間300?ms；分離寬度?2?m/z；全掃描模式定性；采用電噴霧離子化（ESI）方式。

優(yōu)選地，S1所述儲(chǔ)備液，避光保存在2℃下。

優(yōu)選地，S1所述工作標(biāo)準(zhǔn)溶液用完立即避光保存于2℃下，可以每兩天配制一次；

優(yōu)選地，S2所述直接進(jìn)樣優(yōu)選采用注射泵直接進(jìn)樣。

所述以待測煙草樣品溶液制備不同濃度梯度的進(jìn)樣液的不同濃度梯度可以根據(jù)具體實(shí)際需要進(jìn)行確定，例如進(jìn)樣液濃度可設(shè)置梯度為80ng/mL、320ng/mL、960ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL。

本發(fā)明的有益效果是：

????煙草樣品的樣品基質(zhì)與其他樣品基質(zhì)顯著不同，而且煙草中的核黃素含量是極低的，現(xiàn)有技術(shù)中沒有關(guān)于其檢測分析的技術(shù)報(bào)道，也得不到相關(guān)的技術(shù)啟示。本發(fā)明首次從液質(zhì)聯(lián)用分析的角度確證了核黃素是煙草本身含有的一種微量成分，撥開了蒙在本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員眼前的迷霧。