[發明專利]一種TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白、構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201310032694.2
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103113473A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 王強;茍興春;李立亞;熊利澤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/17;A61K47/48;A61P25/00
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

技術領域

本發明屬于蛋白轉導領域，具體涉及將LBD引入TAT-NEP1-40融合制備TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白。同時，本發明還涉及TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白穿過血腦屏障并富集于缺血區，用于中樞神經系統損傷的治療。

背景技術

創傷、中風、腦出血、脊髓損傷等具有高死亡率和高致殘率的特點。如何降低神經功能受損程度和如何更好地使受損神經元功能得到更好地改善，提高患者的生存質量，對患者及其家庭、社會都有重要意義，是一個世界性的難題。目前，對于CNS損傷引起的神經功能障礙尚無有效治療藥物。因此，尋找新型有效的治療腦CNS損傷藥物是研究熱點。

以往普遍認為成年哺乳動物中樞神經系統（central?nervous?system,CNS）損傷引起的神經功能障礙難以恢復的主要原因為神經元不能再生。近二十年來的研究已有突破性進展，目前認為CNS再生困難的原因除促進再生的營養因子不足外，另一重要的原因是中樞的抑制性再生環境。近幾年來，主要抑制受損神經再生的基因－Nogo及其受體(Nogo?receptor,NgR)的發現，為CNS損傷的研究掀開了新的一頁，被譽為是“探索中樞神經損傷修復漫長道路中的一個里程碑”。新近Neuron發表的研究，應用基因敲除(knockout)技術，發現敲除Nogo-A和NgR改善脊髓損傷后再生和可塑反應，應用NgR拮抗劑(NgRecto)治療，促進軸突再生和脊髓損傷的功能恢復。同樣應用Nogo-A抗體(IN-1,7B12)和NgR拮抗劑(NgRecto)治療，顯著改善MACO導致的行為學結果，促進軸突可塑性。為此，Lee等在《Nature?Review?Drug?Discovery》撰寫“Targeting?the?Nogo?receptor?to?treat?central?nervous?system?injuries”的論文，提出“NgR?as?a?drug?discovery?target”，認為以調控NgR為治療目標，可大大促進CNS損傷后神經元的功能恢復，逆轉其災難性的后果。目前NgR成為CNS損傷領域的研究熱點和關注焦點，認為阻斷它可影響腦缺血的發展和結果，促進和增強神經功能恢復。

Nogo-66是Nogo-A分子胞外的袢狀結構，與NgR結合從而觸發下游信號通路阻斷神經的再生。NEP1-40(Nogo?extracellular?peptide?residues1-40)是Nogo-66氨基端40個殘基組成的多肽，保留有Nogo-66與NgR結合的能力，但不觸發下游的信號轉導途徑。NEP1-40作為NgR拮抗劑已經應用于脊髓損傷動物模型，可以促進皮質脊髓軸突的生長和5-羥色胺能神經纖維的出芽，并上調軸突生長蛋白SPRR1A以及突觸的形成，可以顯著促進實驗動物運動功能的恢復。NEP1-40作為NgR拮抗劑，具有高選擇性和有效性使其有望成為治療脊髓損傷、腦外傷、中風和慢性進行性多發性硬化等軸突再生障礙性疾病的新藥。然而，目前研究中所使用的NEP1-40都是經化學合成，其成本較高，且由于血腦屏障(BBB)、血脊屏障、細胞膜等的存在，大于6個氨基酸的多肽一般不能穿過這些屏障，而達不到有效的藥物治療濃度，目前主要是通過顯微定位注射或植入微型泵等手術的形式給藥。顯微注射存在誘發腦內出血等潛在危險，并且只能維持短時期；植入微型泵較好，但存在難以通過血脊屏障、血腦屏障的問題，使NEP1-40的進一步研究和臨床應用受到了極大的限制。目前，已通過應用TAT蛋白轉導技術研制出的新型蛋白TAT-NEP1-40融合蛋白可順利通過血腦屏障，減小腦缺血損傷。但是，TAT蛋白靶向性較差，進入腦內后廣泛分布，不能集中作用于缺血損傷部位。因此，如何使TAT-NEP1-40靶向作用于CNS損傷部位成為現今研究的重點。

層粘連蛋白Laminin是CNS重要的胞外基質。在缺血性腦損傷時，laminin在缺血區域內高表達（Liebkind?RTE.,et?al.，2007），因此，其可成為治療蛋白聚集于缺血損傷區域的一個潛結合靶向區域，明顯增強藥物濃度和治療效率，使治療蛋白更有效的發揮靶向治療損傷神經元的作用。集聚蛋白（Agrin）是神經肌肉接頭突觸后分化的一個關鍵分子，層粘連蛋白和集聚蛋白的氨基端（N-terminal?domain?of?agrin，NtA)有很強的親和能力，NtA可以作為與層粘連蛋白結合的結構域。有研究顯示：通過構建含有神經營養因子BDNF和層粘連蛋白結合區域NtA的融合蛋白，可以靶向聚集于腦缺血損傷區域，并且高效、持續的發揮BDNF的治療作用，而對正常組織和細胞沒有任何副作用（Han,Q.,et?al.,2011）。