[發(fā)明專利]一種基于Fe3O4納米材料免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測方法

有效

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• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103116026A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張錦勝;彭紅;賴衛(wèi)華
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 南昌洪達(dá)專利事務(wù)所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種致病菌的快速檢測方，尤其涉及一種基于Fe₃O₄納米材料免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測方法。

背景技術(shù)

基本原理：單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結(jié)合，這種結(jié)合不會改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學(xué)特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結(jié)合。其主要的原理步驟：1.?利用Fe₃O₄磁珠，包被一層高分子化合物，經(jīng)過修飾后后采用適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑將待檢目標(biāo)菌的單克隆抗體偶聯(lián)在磁珠表面，形成特異性免疫磁珠，并封閉多余活性位點。2.?將另一部分目標(biāo)菌的特異性單克隆抗體采用一定的方法固定在固相載體表面，并將多余活性位點封閉。3.?將制備的特異性免疫磁珠用于抓取富集目標(biāo)菌，通過外加磁場將磁珠分離出來，此時，結(jié)合了目標(biāo)菌的磁珠和沒有結(jié)合目標(biāo)菌的磁珠還是混在一起。4.?將上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相載體表面，則抓取了目標(biāo)菌的磁珠將與固相載體表面單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗可以將未發(fā)生結(jié)合的磁珠洗脫，如不存在目標(biāo)菌，則所有磁珠都被洗掉。5.?再采用洗脫劑將固相載體上結(jié)合的特異性納米免疫磁珠洗下來，用外加磁場將這部分磁珠分離，清洗掉離子、溶劑。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目標(biāo)菌的磁珠。6.加入硝酸和硫酸進(jìn)行硝化反應(yīng)，這部分磁珠如果存在，則Fe₃O₄轉(zhuǎn)化為三價鐵離子和二價鐵離子。所有食品標(biāo)準(zhǔn)中致病菌都是不得檢出的。通過檢測是否存在鐵離子就可以檢測出樣本中是否存在目標(biāo)菌。通過加標(biāo)，在一定范圍內(nèi)可以定量檢測目標(biāo)菌。該方法中Fe₃O₄磁珠既是分離富集的手段，同時也是定量檢測的載體，起了一個信號放大的作用。該方法的主要優(yōu)點就是快速、靈敏度相對較高。相對于致病菌的微生物培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時間。此方法主要取決于樣品的預(yù)處理時間。因此，用該方法可做大規(guī)模待檢樣本的陽性篩選，檢出的陽性樣還需用微生物培養(yǎng)進(jìn)行確證。目前，國內(nèi)外還沒有文獻(xiàn)報道這種方法，但是采用免疫磁珠進(jìn)行致病菌的富集、目標(biāo)物的富集等的報道還是很多的，但沒有采用檢驗鐵離子的方法做進(jìn)一步的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于Fe₃O₄納米材料的免疫磁分離食源性致病菌快速檢測方法，用于對各種不同的食品樣品進(jìn)行評價，該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時間。

一種基于Fe₃O₄的納米免疫磁分離快速檢測出食品中的有害致病菌的方法，通過分離捕獲的免疫磁珠，使其轉(zhuǎn)化為鐵離子，提出鐵離子與目標(biāo)菌的相關(guān)性指標(biāo)，通過檢測鐵離子來間接定量目標(biāo)菌。不同的致病菌檢出下限不同。

該方法依賴于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分離。采用偶聯(lián)了特異性單克隆抗體的免疫磁珠，可以將樣品中的特異性致病菌進(jìn)行富集；通過設(shè)計雙抗夾心分離捕獲到目標(biāo)菌的磁珠，再將磁珠硝化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為三價鐵離子和二價鐵離子。采用鄰二氮菲吸光光度法、硫氰酸鉀比色法等可以檢測出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過加標(biāo)定量磁珠而在一定程度間接定量出目標(biāo)菌的量。通過定量分析捕獲目標(biāo)菌的磁珠含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測出的致病菌含量與磁珠含量線性相關(guān)，擬合度較好。最終以免疫磁珠與致病菌間的對應(yīng)關(guān)系為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數(shù)。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，步驟如下：

1）檢測目標(biāo)菌的特異性免疫磁珠的制備；

2）將目標(biāo)菌特異性單克隆抗體固定在固相載體表面；

3）免疫磁珠富集目標(biāo)菌株，并分離：將第1步制得的免疫磁珠加入待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標(biāo)菌后通過施加外加磁場，則磁珠就匯集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠，若待檢樣本中有目標(biāo)菌，則被磁珠所富集，加少量無菌的去離子水則形成目標(biāo)菌的磁珠懸濁液；

4）將富集的磁珠懸濁液加到第２步制作的固定了單克隆抗體的固相載體上，若存在目標(biāo)菌則形成雙抗夾心；用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標(biāo)菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標(biāo)菌，則所有磁珠都被洗掉；

5）之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來，用外加磁場分離磁珠的方法分離磁珠，用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠，這部分磁珠就是抓到目標(biāo)菌的磁珠；