[發明專利]用于檢測分枝桿菌的引物對和標準品以及它們的應用

有效

• 申請號: 201310031783.5
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103088139A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李丹;林怡雯;何苗
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及用于檢測分枝桿菌的引物對和標準品以及它們的應用。

背景技術

大多數分枝桿菌均為機會致病菌，常存在于自然水體、工程供水系統及室內給排水管件中。目前從環境中分離出來的分枝桿菌已經超過150多種，而且數量還在不斷增多，它們可在人群中引起多種感染性疾病。

目前，培養法是檢測分支桿菌的金標法，精確可靠，但所需時間較長（4-8周），而且很多分支桿菌是無法培養的，目前培養法計數結果只有顯微鏡計數結果的十分之一。熒光定量PCR（qPCR）方法是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法方法，具有特異性更強、靈敏度更高、檢測周期更短、能有效解決PCR污染問題、自動化程度高等優點。采用實時熒光定量PCR對分枝桿菌的定量證實了這個現象。采用qPCR定量基因拷貝數和細胞數的結果通常比培養法高10倍左右，與顯微鏡計數法的結果相一致。

此外，用于分枝桿菌檢測的實驗室檢測方法還包括氣相質譜分析、液相質譜分析。氣相質譜和液相質譜分析需要昂貴的儀器，不適合常規檢測。

發明內容

本發明的目的是提供用于檢測分枝桿菌的引物對和標準品以及它們的應用。

本發明提供了用于輔助鑒定分枝桿菌的特異引物對，由序列表的序列2所示的單鏈DNA片段和序列表的序列3所示的單鏈DNA片段組成。

本發明還保護所述特異引物對在制備輔助鑒定分枝桿菌的試劑盒中的應用。

本發明還保護一種輔助鑒定分枝桿菌的試劑盒，包括所述特異引物對和標準品；所述標準品為序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子或含有序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子的質粒。所述含有序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子的質粒具體可為將序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子插入18-T?Vector，得到的重組質粒pMD-18T-hsp65。

本發明還保護所述特異引物對和所述標準品在制備輔助鑒定分枝桿菌的試劑盒中的應用。

本發明還保護所述引物對在輔助鑒定分枝桿菌中的應用。

本發明還保護一種輔助鑒定分枝桿菌的方法，包括如下步驟：以待測細菌的基因組DNA為模板，用所述特異引物對進行PCR擴增，如果得到365±5bp（具體可為365bp）的PCR擴增產物待測細菌為候選的分枝桿菌，如果沒有得到365±5bp（具體可為365bp）的PCR擴增產物待測細菌為候選的非分枝桿菌。

本發明還保護所述特異引物對或所述試劑盒在定量檢測分枝桿菌中的應用。

本發明還保護所述特異引物對或所述試劑盒在檢測待測水樣中分枝桿菌的含量中的應用。

本發明還保護一種檢測待測水樣中的分枝桿菌含量的方法，包括如下步驟：

（1）按照如下方法制作標準曲線；以所述標準品為模板，采用所述特異引物對進行實時熒光定量PCR，以實時熒光定量PCR體系中的標準品的拷貝數和實時熒光定量PCR得到的Ct值制作標準曲線方程；

（2）從待測水樣中提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用所述特異引物對進行實時熒光定量PCR，將Ct值代入所述標準曲線方程，得到待測水樣中的分枝桿菌含量。

所述實時熒光定量PCR的初始體系中，所述特異引物對的每條引物的濃度具體可為0.2μmol/L。所述實時熒光定量PCR的反應程序中，退火溫度具體可為56°C。所述實時熒光定量PCR的反應程序具體可為：（95°C、5min）×1個循環；（95°C、5s，56°C退火30s、72°C、30s）×40個循環。

以上任一所述的分枝桿菌具體可為偶發分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、迪氏分枝桿菌和牦牛分枝桿菌中的至少一種。

本發明提供了針對分枝桿菌特異性良好的特異引物對，并提供了對于分枝桿菌菌株具有通用性的標準品，可以輔助鑒定分枝桿菌，也可以借助熒光定量檢測待測液體樣本或待測固體樣本溶液中的分枝桿菌含量，具有靈敏度高、特異性好、檢測快速等優點、且可以檢測到無法培養的細菌，從而檢測結果更為準確。本發明為飲用水安全、再生水安全等提供了技術支持。

附圖說明

圖1為實時定量PCR中優化退火溫度的結果。

圖2為實時定量PCR中優化初始體系中的引物濃度的結果。

圖3為實施例3的特異性實驗中的擴增曲線。

圖4為實施例3的特異性實驗中的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5為實施例4中的擴增曲線。

圖6為實施例4中的標準曲線。