[發明專利]豌豆細菌性疫病菌熒光PCR快速檢測引物及試劑盒

無效

• 申請號: 201310027540.4
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103966305A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 鄭媛;王曼霞
• 申請（專利權）人: 鄭媛
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于植物檢疫檢測技術領域，具體涉及一種豌豆細菌性疫病菌熒光PCR快速檢測引物及包含該引物的試劑盒。

背景技術

豌豆細菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv.pisi)是《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中規定的檢疫性有害生物，在世界各地分布較為廣泛。寄主包括豌豆屬、扁豆屬、香豌豆屬、野豌豆屬、豇豆屬、天藍苜蓿等植物，可引起葉片、莖、花梗、花和豆莢等萎蔫枯死，導致植株猝倒，對產量影響較大，是各國嚴格限制入境的有害生物之一，也是我國進境植物檢疫性病原細菌的一種，是進出境植物產品特別是豌豆源性產品的重要檢疫對象。該病害由種子帶菌，即使只有0.01％種子被感染也可導致嚴重的病發。

豌豆細菌性疫病菌的傳統檢測與鑒定方法主要為病菌分離及致病性測定、血清學檢測技術、脂肪酸甲酯分析及核酸檢測。分離及致病性測定一般需要3d以上的時間才能觀察到有效癥狀。在脂肪酸甲酯分析中，提取細菌脂肪酸甲酯，用氣相色譜法分析其成份比例，鑒定結果的敏感度與致病性測定方法結果相同。缺點是檢測無癥帶菌植株的靈敏度不如選擇性培養基。綜上所述，這些傳統方法方法費時，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要；

乙烯合成酶基因(ethylene-forming enzyme(efe)gene)基因是指作為豌豆細菌性疫病菌保守程度較高的序列，可被用來進行該菌的分子生物學檢測和鑒定。現代檢測技術越來越傾向于聚合酶鏈式反應法(PCR法)等分子檢測手段，該方法較傳統方法快速、靈敏，目前我國尚未見用熒光PCR方法檢測豌豆細菌性疫病菌的方法。

發明內容

本發明的目的是提供豌豆細菌性疫病菌熒光PCR快速檢測，即一種能夠通過檢測豌豆細菌性疫病菌基因(PSS-EFE)來判斷檢測樣品中是否存在豌豆細菌性疫病菌的熒光引物。

本發明的熒光引物，包括：

1)序列為SEQ ID NO：1的上游引物和序列為SEQ ID NO：2的下游引物；

2)對1)中的引物對通過轉換、插入、缺失或5’添加基所形成的引物對，且引物對擴增的產物在嚴謹條件下與1)的引物的擴增產物發生雜交；

3)在1)或2)所描述的擴增片段上設計得到的引物對

本發明的豌豆細菌性疫病菌的熒光PCR快速檢測試劑盒，包括如下組分

1)2倍濃度的PCR體系預混合物；

2)上游引物和下游引物，濃度分別為10μmol/L；

3)20倍濃度的熒光染料；

4)DNA樣品/報告質粒，10μg/μL；

5)雙蒸水。

本發明根據PSS-EFE基因保守序列，通過分子生物學分析獲得了特異性引物，該保守基因序列為具有EFE基因的不同豌豆細菌性疫病菌株系所共有，以保證從種的水平上檢測不同來源的PSS-EFE基因的可靠性。另外，本發明的引物采用熒光標記，與普通PCR技術相比，不必用凝膠電泳方法來觀察，實現了檢測流程一體化封閉檢測。

具體實施方式

1、本發明根據PSS-EFE基因保守序列，通過分子生物學分析獲得了特異性引物，該引物包括：

1)序列為SEQ ID NO：1的上游引物和序列為SEQ ID NO：2的下游引物；

2)對1)中的引物對通過轉換、插入、缺失或5’添加基所形成的引物對，且引物對擴增的產物在嚴謹條件下與1)的引物的擴增產物發生雜交；

3)在1)或2)所描述的擴增片段上設計得到的引物對

2、對于2)中描述的引物，包括在引物的5’添加了內切酶識別標識片段所形成的長度不同引物，以及堿基替換、插入、刪除所形成的變異引物。這些由序列為SEQ ID NO：1的上游引物和序列為SEQ ID NO：2的下游引物所衍生出的引物也能用來檢測豌豆細菌性疫病菌，即2)中所描述的衍生引物所擴增出的核苷酸片段能夠在嚴謹條件下與1)的引物的擴增產物發生雜交；所述的嚴謹條件參照Roche公司的DIG高效DNA標記及檢測Starter Kit1手冊中的雜交條件。

本發明的引物用于熒光PCR檢測PSS-EFE基因，PCR反應體系中各組分構成比例如下：

PCR反應程序：

(1)94℃預變性3min；

(2)94℃變性25s；55℃退火，30s，72℃延伸30s，循環40次。

(3)最后加做熔解曲線(95℃15sec，60℃15sec，95℃，15sec)