[發(fā)明專利]一重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的制備及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310027150.7
• 申請(qǐng)日: 2013-01-25
• 公開（公告）號(hào): CN103966206A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾凡榮;王曉婧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C07K14/00;C12N15/63;C12P21/02;A01N47/44;A01P7/04;A01H5/00;A61K38/16;A61P3/10;A61P3/04;A61P3/06;A61P9/10;A23L1/305;A
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的氨基酸和基因序列及其制備和應(yīng)用。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。發(fā)明涉及微生物源α-淀粉酶抑制劑的氨基酸序列、表達(dá)該抑制劑的基因核苷酸序列；發(fā)明也涉及重組的α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)在醫(yī)藥、蛋白質(zhì)農(nóng)藥和害蟲治理中的應(yīng)用；本發(fā)明的應(yīng)用還涉及該α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)在減肥、保健食品和飲料加工生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

α-淀粉酶抑制劑是一類可以抑制α-淀粉酶的糖苷水解酶抑制劑，它對(duì)哺乳動(dòng)物和昆蟲α-淀粉酶活性有特異性抑制作用。生物源α-淀粉酶抑制劑大致分4種類型：(1)微生物產(chǎn)含氮碳水化合物；(2)微生物產(chǎn)多肽，如從鏈霉菌S.tendae中分離得到的Tendamistat蛋白質(zhì)；(3)谷類、豆類以及其它較高等植物中發(fā)現(xiàn)的大分子蛋白質(zhì)類α-淀粉酶抑制劑；(4)利用生物技術(shù)制備的工程菌株表達(dá)得到的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)。用工程菌提取的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)比傳統(tǒng)方法提取的天然α-淀粉酶抑制劑純度高，來源穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，因此重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)在農(nóng)、林業(yè)、醫(yī)藥和保健領(lǐng)域、食品和飲料加工生產(chǎn)中的應(yīng)用前景十分廣闊。

該發(fā)明在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝或裝飾植物害蟲治理中的應(yīng)用：α-淀粉酶抑制劑對(duì)某些害蟲的α-淀粉酶具有抑制作用，將它作為抗蟲基因用于轉(zhuǎn)基因植物來提高植物的抗蟲性；也可將α-淀粉酶抑制劑制成生物農(nóng)藥，其抗蟲性比較穩(wěn)定，在農(nóng)產(chǎn)品中無殘留，有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

該發(fā)明在醫(yī)藥上的應(yīng)用：近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人長時(shí)間高血糖水平是導(dǎo)致病人多系統(tǒng)和多臟器損害的主要原因，因此，減少淀粉分解為單糖從而降低餐后血糖水平對(duì)糖尿病人就顯得十分重要。α-淀粉酶抑制劑能有效地抑制消化道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，從而降低血糖，因此α-淀粉酶抑制劑具有重要的藥用價(jià)值潛力，它可用于防治高血糖和糖尿病以及能量過甚引起的高血脂等。同時(shí)，大多數(shù)α-淀粉酶抑制劑具有對(duì)哺乳動(dòng)物無毒，在低濃度即可發(fā)揮很高的生物活性等優(yōu)點(diǎn)。

該發(fā)明另一個(gè)重要應(yīng)用方面是減肥和保健方面。能量攝入過多是引起肥胖的主要原因。α-淀粉酶抑制劑能夠在生物體內(nèi)抑制所攝入食物向能量轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)對(duì)哺乳動(dòng)物的α-淀粉酶具有很強(qiáng)的抑制作用，可以特異性的抑制哺乳動(dòng)物源α-淀粉酶，因此α-淀粉酶抑制劑可以使消費(fèi)者在消費(fèi)含α-淀粉酶活性抑制劑的食品和飲料時(shí)減少能量的攝入，從而產(chǎn)生一種有效的減肥、保健方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明包括以下內(nèi)容：

1.本發(fā)明提供一種編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸分子SEQ ID No.1，所述的多核苷酸分子包括與SEQ ID No.1基本相符合的核苷酸序列以及與SEQ ID No.1所示的核苷酸序列部分相符合并具有相似功能的片斷。

2.本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)包含與SEQ ID No.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。及該蛋白質(zhì)的制備方法。該方法包括：

(1)、α-淀粉酶抑制劑基因的克?。阂蕴崛〉幕蚪MDNA為模板PCR擴(kuò)增α-淀粉酶抑制劑基因，回收PCR產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定；

(2)、α-淀粉酶抑制劑基因的表達(dá)：以鑒定過的陽性克隆為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出α-淀粉酶抑制劑基因全長，與原核表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的菌種，37℃振蕩培養(yǎng)，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)；

(3)、重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)的純化：將含重組質(zhì)粒的工程菌大量誘導(dǎo)表達(dá)，并將重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)變性，然后利用親和樹脂柱純化α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)；

(4)、純化重組α-淀粉酶抑制劑蛋白質(zhì)復(fù)性。

3.本發(fā)明提供一種表達(dá)載體或宿主細(xì)胞，其特征在于它含有基本及部分相符合的SEQ ID NO.1多核苷酸分子序列。

4.一種重組微生物或工程菌株，該重組微生物的特征在于它含有以上1所述的基本及部分相符合的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化得到并表達(dá)該多核苷酸分子，或根據(jù)以上2-3所述的重組微生物，該重組微生物的特征在于它表達(dá)的蛋白質(zhì)含有與SEQ ID No.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。

5.一種藥物組合物，其特征在于它含有以上1-4所述的重組微生物或工程菌株的發(fā)酵液或產(chǎn)物。該組合物被用于制備α-淀粉酶抑制劑類的生物農(nóng)藥劑或應(yīng)用于醫(yī)藥和生化領(lǐng)域。