[發明專利]試管慈姑組織培養快速繁殖的方法

無效

• 申請號: 201310024276.9
• 申請日: 2013-01-22
• 公開（公告）號: CN103070073A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 朱紅蓮;柯衛東;劉玉平;彭靜;黃新芳;劉義滿;李峰;李雙梅;黃來春;葉元英
• 申請（專利權）人: 武漢市蔬菜科學研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 馬輝

技術領域

本發明屬于農業育種領域，具體地指一種試管慈姑組織培養快速繁殖的方法。

背景技術

慈姑為多年生水生草本植物，以其球莖供食用，我國是慈姑原產地之一，長江流域及其以南各省普遍栽培，太湖沿岸及珠江三角洲為主產區，北方少量栽培。慈姑主要以慈姑球莖或球莖頂芽作種進行無性繁殖，繁殖系數低，一年只繁殖一代，用種量大，限制了慈姑新優品種的推廣速度。

因此，通過組織培養快速繁殖進行試管慈姑的生產是解決上述問題的有效途徑之一。現階段，慈姑的組織培養研究工作主要由國內研究人員進行，而國外對其研究較少。貴州師范大學等開展了一些研究工作，但只得到慈姑試管苗和匍匐莖。慈姑試管苗和匍匐莖不利于遠距離運輸和貯存。

發明內容

本發明的目的是針對無性繁殖的慈姑的種球帶病和種性退化問題，提供一種試管慈姑組織培養快速繁殖的方法，提高慈姑的品質。

本發明試管慈姑組織培養快速繁殖的方法，包括以下步驟：

1）外植體的消毒處理：選取無病蟲危害的慈姑球莖，清洗干凈后，切取球莖頂芽為外植體，流水沖洗20～35min，濾干后剝去最外面1～2層鱗片進行消毒處理，先用質量分數為72%硫酸鏈霉素處理10～30min，再用質量分數為70%乙醇表面消毒20～40s，最后用質量分數為0.1%HgCl₂溶液處理2～5min；

2）莖尖分化：消毒處理后的慈姑用無菌水沖洗4～5次，剝去2～3層鱗片，切取莖尖接種于啟動培養基上，所述啟動培養基為1/2MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）1.0～2.0mg/L、萘乙酸（NAA）0.1～0.5mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為0～0.5%的瓊脂，pH值為5.8～6.0，培養溫度25℃～28℃，光照強度1000～1500?lx，每天光照時間10h，直至長成再生小植株；

3）繼代增殖：將莖尖誘導的再生小植株轉接到增殖培養基中進行繼代增殖培養，所述增殖培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）1.0～3.0?mg/L、萘乙酸（NAA）?0.1～0.3mg/L、質量分數為3.0%的蔗糖和質量分數為0～0.5%的瓊脂，pH值為5.8～6.0，培養溫度25℃～28℃，光照強度1000～1500?lx，每天光照時間10h，直至萌發形成分株的慈姑試管苗；

4）誘導試管慈姑：將慈姑試管苗轉接到誘導培養基上，所述誘導培養基為MS培養基、添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）0～3.0mg/L、萘乙酸（NAA）0～0.3mg/L、活性炭（AC）0.5～1.0g/L、質量分數為3.0%～8.0%的蔗糖和質量分數為0～0.5%的瓊脂，pH值為5.8～6.0，在培養溫度14℃～22℃，每天光照時間0～12h的條件下誘導形成試管慈姑。

本發明在外植體的消毒處理中，延長了質量分數為72%硫酸鏈霉素的處理時間，相應縮短了0.1%升汞的處理時間。因為升汞（HgCl₂）的毒性很大，在對外植體進行消毒的同時，也對外植體造成很大的傷害，重則導致材料死亡，所以在對消毒處理步驟優化后，可以將慈姑莖尖成活率提高了5～10個百分點。

本發明在莖尖分化階段中，選擇慈姑莖尖分化啟動培養基中的基本培養基為1/2MS培養基，將MS的大量元素進行減半。這樣，由于降低了無機鹽的濃度更加有利于根的分化，從而將慈姑莖尖分化率提高了2～3個百分點，同時也降低了培養基的成本。

本發明在繼代增殖階段中，由于6-BA濃度高易導致組培試管苗分化過多，苗小，生長慢，有畸形苗，且6-BA的累積易引起組培試管苗玻璃化，造成組培試管苗死亡率高，且性狀難以穩定。因此，通過優化增殖培養基中6-BA的濃度，在降低增殖培養基中6-BA的濃度的同時又能提高組培試管苗的成活率。

本發明在誘導試管慈姑階段中，在誘導培養基中添加了活性炭AC。AC的添加不僅給試管慈姑提供了更加適于誘導的暗環境，還可吸附離體培養中的抑制物，同時AC對高質量濃度的6-BA和NAA等也產生一定的吸附作用，有利于誘導出更多、更大且整齊度高的試管慈姑。

本發明通過組織培養進行試管慈姑的繁殖，具有以下優點：

第一，繁殖系數高，繁殖周期短，且整個繁殖過程均在人工控制的條件下進行，不受外界環境影響，可以進行周年生產，一年可繁殖6～8代；而慈姑常規生產用種一年只可繁殖一代。本發明極大提高了慈姑的繁殖速度，有利于優新慈姑品種的推廣應用。