[發(fā)明專利]一種納米磁微粒與抗體偶聯(lián)的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310024221.8
• 申請(qǐng)日: 2013-01-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103149350A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于大為;程曉蕾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/531
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/531
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi);趙艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米磁微粒與抗體偶聯(lián)的方法。背景技術(shù)

磁性分離技術(shù)是以納米或微粒級(jí)的磁性微粒為載體，利用結(jié)合于磁性微粒表面的蛋白質(zhì)所提供的特異的親和特性，在加磁場(chǎng)的定向控制下，通過(guò)親和吸附、清洗、解吸操作，可以進(jìn)一步從復(fù)雜的生物體系中分離到目標(biāo)物分子，具有磁性分離簡(jiǎn)單方便、親和吸附高特異性及高敏感性等眾多優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用于磁性分離技術(shù)的磁性載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①粒徑比較小，比表面積較大，具有較大的吸附容量；②物理和化學(xué)性能穩(wěn)定，有較高機(jī)械強(qiáng)度，使用壽命長(zhǎng)；③含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，以用于親和配基的固定化；④粒徑均一，能形成單分散體系；⑤懸浮性好，便于反應(yīng)的有效進(jìn)行。

納米技術(shù)的出現(xiàn)，促進(jìn)了磁性微粒的應(yīng)用。納米磁微粒粒徑小，加至反應(yīng)液中呈懸浮狀態(tài)，加磁場(chǎng)后可迅速分離。納米磁微粒還可通過(guò)免疫反應(yīng)與標(biāo)記有熒光素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶等物質(zhì)連接，建立各種免疫分析方法。

納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑綜合采用了目前國(guó)際上的兩大主流免疫分析尖端技術(shù)——懸浮納米磁微粒載體技術(shù)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，能夠準(zhǔn)確定量的檢測(cè)人類(lèi)血清中的免疫抗原或抗體，可用于過(guò)敏、自身免疫、甲狀腺功能、腫瘤、性激素、傳染病等相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)。然而，不同的納米磁微粒和抗體的偶聯(lián)方法，會(huì)導(dǎo)致偶聯(lián)上抗體活性的不同，影響試劑的靈敏度。現(xiàn)有技術(shù)中，納米磁微粒和抗體偶聯(lián)過(guò)程中偶聯(lián)劑和抗體易接觸導(dǎo)致抗體活性下降，試劑的靈敏度較低。因此，開(kāi)發(fā)一種納米磁微粒和抗體的偶聯(lián)方法，保證抗體偶聯(lián)到納米磁微粒上后保持較高的活性，確保試劑的靈敏度，是該平臺(tái)發(fā)展的核心技術(shù)之一。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種納米磁微粒與抗體偶聯(lián)的方法，以解決納米磁微粒包被抗體后活性下降，試劑靈敏度低的問(wèn)題，提高納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫診斷試劑的靈敏度。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種納米磁微粒與抗體偶聯(lián)的方法，其特征在于，具體步驟為：

（1）取含有磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用2-嗎啉乙磺酸（MES）緩沖液重懸；

（2）加入新鮮配制的碳二亞胺（EDC）水溶液，室溫混懸；

（3）磁分離去上清，加入2-嗎啉乙磺酸緩沖液重懸；

（4）加入抗體，室溫混懸；

（5）磁分離，去上清，用磁微粒保存液重懸。

較佳地，所述步驟（1）和（2）中，所述的2-嗎啉乙磺酸緩沖液為2-嗎啉乙磺酸的摩爾含量為0.05mol/L，pH4~6的2-嗎啉乙磺酸緩沖液。

較佳地，本發(fā)明提供一種納米磁微粒與抗體偶聯(lián)的方法的具體步驟為：

（1）取含有100mg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用0.05mol/L，pH4~62-嗎啉乙磺酸緩沖液10ml重懸；

（2）加入0.5~2ml新鮮配制的10mg/ml的碳二亞胺水溶液，室溫混懸；

（3）磁分離去上清，加入0.05mol/L,pH4~62-嗎啉乙磺酸緩沖液10ml重懸；

（4）加入4mg的抗體，室溫混懸；

（5）磁分離，去上清，用磁微粒保存液重懸到1mg/ml。

較佳地，所述的磁微粒為表面帶有羧基的納米磁微粒，直徑200納米至3微米。

較佳地，所述的抗體為多克隆抗體或者單克隆抗體，純度為90wt%以上。

較佳地，所述步驟（2）和（3）中，室溫溫懸的時(shí)間為1～5h。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的納米磁微粒與抗體偶聯(lián)的方法，以兩步清洗偶聯(lián)法將納米磁微粒與抗體偶聯(lián)，避免了偶聯(lián)過(guò)程中偶聯(lián)劑EDC和抗體接觸導(dǎo)致抗體活性下降的缺陷，本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，成本低，可用于納米磁微粒和多種抗體的偶聯(lián)，解決了納米磁微粒偶聯(lián)抗體后，抗體活性下降導(dǎo)致試劑靈敏度低的問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例一中AFP試劑的靈敏度評(píng)價(jià)擬合曲線。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例二中AFP試劑的靈敏度評(píng)價(jià)擬合曲線。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例三中AFP試劑的靈敏度評(píng)價(jià)擬合曲線。

具體實(shí)施方式

以甲胎蛋白（AFP）單克隆抗體偶聯(lián)的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)試試劑為例，將AFP單抗和納米磁微粒采用以下方法偶聯(lián)。使用市售的Maglia60化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定AFP試劑的靈敏度。

其中，所述的甲胎蛋白單克隆抗體偶聯(lián)的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)試試劑（APF試劑）包括：含有熒光素（FITC）標(biāo)記的AFP抗體的溶液（簡(jiǎn)稱第一試劑）和包被有熒光素抗體的磁微粒的懸浮液（簡(jiǎn)稱磁分離試劑），以及堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記的AFP抗體的溶液（簡(jiǎn)稱第二試劑）。