[發(fā)明專利]一種人羊膜的脫細胞方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310023898.X | 申請日： | 2013-01-23 |
| 公開（公告）號： | CN103114073A | 公開（公告）日： | 2013-05-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 竺亞斌;史佩娜;沈秋霞;高夢娜;盧珍珍 | 申請（專利權(quán)）人： | 寧波大學(xué) |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226 | 代理人： | 蔡菡華 |
| 地址： | 315211 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 羊膜 細胞 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人羊膜的脫細胞方法。
背景技術(shù)
脫細胞技術(shù)是指通過一系列方法處理人和動物的組織和/或器官，使該組織和/或器官的細胞完全去除，而保留相應(yīng)的細胞外基質(zhì)的方法。它在組織工程支架的構(gòu)建中起著重要的作用。羊膜，即人胎盤粘膜，是一光滑的、無血管、神經(jīng)及淋巴的、具有彈性的半透明膜，厚約0.02~0.5mm，由單層上皮細胞層、致密的基底膜以及無血管的基質(zhì)等成份組成。羊膜基質(zhì)中含有大量的膠原、纖粘連蛋白和層粘連蛋白等成份，是一種廉價易得、性能優(yōu)良的組織工程支架材料。但將其作為一種切實可用的支架材料應(yīng)用于組織構(gòu)建的主要問題在于要克服其內(nèi)在細胞所帶來的免疫原性。
目前對羊膜組織的脫細胞處理的方法，主要在于采用表面活性劑或表面活性劑結(jié)合機械力刮除等，這些方法無法完整地保留羊膜細胞外基質(zhì)，對羊膜基質(zhì)的力學(xué)和化學(xué)等性能均有不同程度的損傷，而且脫細胞效率比較低，適用范圍比較窄。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效脫細胞的同時可完整地保留細胞外基質(zhì)的人羊膜的脫細胞方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種人羊膜的脫細胞方法，包括以下具體過程：
（1）、將新鮮的人胎盤羊膜除去血塊和絨毛膜，留下包含上皮細胞層、基底膜和無血管基質(zhì)的完整羊膜組織，并以pH值為7.4的磷酸緩沖液（簡稱PBS）清洗，得到一干凈半透明的羊膜；
（2）、取體積濃度為75%的酒精將上述得到的半透明羊膜漂洗1～2次，再用PBS漂洗2～4次，然后將青霉素和鏈霉素混合到PBS中形成雙抗/PBS溶液，所述的青霉素和鏈霉素又叫雙抗，其中青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100～300U/L，再將半透明羊膜按體積比為1:1～3的比例置于雙抗/PBS溶液中浸泡震蕩，每12小時換液一次，共兩次；
（3）、將雙抗、表面活性劑混合到PBS中形成綜合PBS溶液，其中：青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100～300U/L，表面活性劑占PBS的重量比為1%，并將半透明羊膜按體積比為1:1～3的比例置于綜合PBS溶液中浸泡震蕩，每6～8小時換液一次，共兩次，然后將半透明羊膜取出，用PBS漂洗1～2次；
（4）、將半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量為500～5000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜與胰脂酶/PBS溶液的體積比為1:1～3，并在溶液溫度為30～40℃下處理10～20小時，然后將半透明羊膜取出用PBS漂洗1～2次，再將半透明羊膜浸泡在DNA酶（又叫脫氧核糖核酸酶）含量為1000～3000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜與DNA酶/PBS溶液的體積比為1:1～3，在溶液溫度為30～40℃下處理3～5小時；
（5）、將半透明羊膜從DNA酶/PBS溶液中取出，并將半透明羊膜置于青霉素與鏈霉素含量均為100～300U/L的雙抗/PBS溶液中震蕩漂洗，每12小時換液一次，共兩次，最后將脫細胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4℃的溫度下保存待用。
所述的表面活性劑采用Triton?X-100（曲拉通100）。?
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于該方法采用表面活性劑結(jié)合胰脂酶和DNA酶共同來脫除羊膜中的細胞，脂類是細胞膜的主要成份，DNA存在于細胞核中，是遺傳信息的攜帶者，胰脂酶和DNA酶能針對性地分別降解細胞膜和細胞核中的DNA，將二者結(jié)合起來使用可以促使羊膜中的細胞被高效徹底地脫去，同時最大程度地保留細胞外基質(zhì)，使其不受損傷。另一方面，本發(fā)明針對真核細胞共同具有的結(jié)構(gòu)成份進行處理，因此本發(fā)明適用于任何真核細胞的脫除，其使用具有普適性。
具體實施方式
以下對本發(fā)明作進一步詳細描述。
實施例一：一種人羊膜的脫細胞方法，包括以下具體過程：
（1）、將新鮮的人胎盤羊膜除去血塊和絨毛膜，留下包含上皮細胞層、基底膜和無血管基質(zhì)的完整羊膜組織，并以pH值為7.4的磷酸緩沖液（簡稱PBS）清洗，得到一干凈半透明的羊膜；
（2）、取體積濃度為75%的酒精將上述得到的半透明羊膜漂洗2次，再用PBS漂洗2次，然后將青霉素和鏈霉素混合到PBS中形成雙抗/PBS溶液，其中青霉素與鏈霉素在PBS中的含量均為100U/L，再將半透明羊膜按體積比為1:1的比例置于雙抗/PBS溶液中浸泡震蕩，每12小時換液一次，共兩次；
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