[發明專利]肌氨酸氧化酶親和介質及其合成和純化肌氨酸氧化酶的方法

有效

• 申請號: 201310022527.X
• 申請日: 2013-01-21
• 公開（公告）號: CN103055825A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 楊海麟;辛瑜;仝艷軍;王武;張玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: B01J20/26
• 分類號: B01J20/26;B01D15/38;C12N9/06;C08B37/08
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種肌氨酸氧化酶親和介質及其合成和大規模純化肌氨酸氧化酶的方法，屬于生物工程技術領域，特別涉及診斷用酶生產技術領域。

背景技術

肌氨酸氧化酶（sarcosine?oxidase,?E.C.1.5.3.1）簡稱SOX，是肌酐降解代謝途徑中的第三個酶，能專一性地催化底物肌氨酸生成甘氨酸。微生物是肌氨酸氧化酶最為主要的來源，其在臨床診斷中有廣泛的應用，通過肌氨酸氧化酶偶聯肌酐酶、肌酸酶測定血清中肌酐的含量，是判斷腎臟功能的一個重要參考指標，在醫藥領域具有良好的應用前景。

Bacillus?(芽孢桿菌)，Streptomyces?sp.（鏈霉菌），Corynebacterium（棒狀桿菌），Arthrobacter（節桿菌）和Pseudomonas（假單胞菌）等微生物都可以生產肌氨酸氧化酶。目前，多種肌氨酸氧化酶基因已經被克隆，并轉入E.coli（大腸桿菌）等基因工程菌進行表達。然而肌氨酸氧化酶的分離純化步驟通常包括了多步的硫酸銨沉淀，表面活化劑處理，熱處理，離子交換層析，分子篩層析等。而過多的純化步驟，導致了純化時間較長，蛋白和活性回收率較低的結果。

為了大規模工業化地生產肌氨酸氧化酶，必須減少分離純化的步驟。因此，需要提供一種快速高效的肌氨酸氧化酶分離方法。

發明內容

本發明的目的是克服了上述現有技術中的缺點，提供一種肌氨酸氧化酶親和介質及其合成和大規模純化肌氨酸氧化酶的方法，利用該肌氨酸氧化酶親和介質可以大規模快速分離純化肌氨酸氧化酶，可在僅用一步親和層析的情況下，得到肌氨酸氧化酶純品，整個純化步驟消耗時間短，蛋白和活性回收率較高，適于大規模推廣應用。

為了實現上述目的，在本發明的第一方面，提供了一種肌氨酸氧化酶親和介質，其特點是，所述肌氨酸氧化酶親和介質由肌氨酸氧化酶親和配體和層析介質連接而成；肌氨酸氧化酶親和配體和所述層析介質通過乙二胺作為間隔臂進行連接。

較佳地，所述肌氨酸氧化酶親和配體是4-氨基吡咯-2-羧酸，所述層析介質是Sepharose或聚殼聚糖。即肌氨酸氧化酶親和介質為：

A、Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸，或B、聚殼聚糖-4-氨基吡咯-2-羧酸。

在本發明的第二方面，提供了一種上述的肌氨酸氧化酶親和介質的合成方法，其特點是：

A、Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸的合成：

（1）介質活化：100?g?Sepharose?CL?4B用10倍量的去離子水-記為體積V-洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于50?mL緩沖液，40℃搖床震蕩2.5?h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經過每次V體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，再抽干成濕餅狀，得活化的Sepharose?CL?4B；

所述緩沖液為0.8?M?NaOH、20%二甲亞砜和10%環氧氯丙烷的溶液，下同；

（2）接間隔臂乙二胺：活化的Sepharose?CL?4B層析介質懸浮于100?mL去離子水中，按照1:2的摩爾比例加入乙二胺，凝膠在攪拌下60?℃恒溫12?h；用去離子水清洗；所得氨基-Sepharose?CL?4?B再次懸浮在50mL的緩沖液中，40℃搖床震蕩2.5?h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經過每次V體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，再抽干成濕餅狀，獲得活化的氨基-Sepharose?CL?4B介質；

（3）連接親和配體：稱取1g?4-氨基吡咯-2-羧酸，溶解于80?mL去離子水中，加入已抽干的活化氨基-Sepharose?CL?4B介質，在50-60℃振蕩24?h，反應過程中時常檢查pH，用1M?NaOH使溶液保持在11-12之間；反應完畢，用500?mL去離子水充分洗滌，抽干，得Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸；

B、聚殼聚糖-4-氨基吡咯-2-羧酸的合成

（ⅰ）介質活化：100?g聚殼聚糖用10倍量的去離子水-記為體積V-洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于50?mL?緩沖液，40?℃搖床震蕩2.5?h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經過每次V體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀，得活化的聚殼聚糖介質；?