[發(fā)明專利]肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)及其合成和純化肌氨酸氧化酶的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201310022527.X | 申請(qǐng)日： | 2013-01-21 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN103055825A | 公開（公告）日： | 2013-04-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 楊海麟;辛瑜;仝艷軍;王武;張玲 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 江南大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | B01J20/26 | 分類號(hào)： | B01J20/26;B01D15/38;C12N9/06;C08B37/08 |
| 代理公司： | 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104 | 代理人： | 時(shí)旭丹;劉品超 |
| 地址： | 214122 江蘇省無*** | 國(guó)省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 氨酸 氧化酶 親和 介質(zhì) 及其 合成 純化 方法 | ||
1.一種肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)，其特征在于，所述肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)由肌氨酸氧化酶親和配體和層析介質(zhì)連接而成；肌氨酸氧化酶親和配體和層析介質(zhì)通過乙二胺作為間隔臂進(jìn)行連接；
所述肌氨酸氧化酶親和配體是4-氨基吡咯-2-羧酸，所述層析介質(zhì)是Sepharose或聚殼聚糖；
即肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)為：
A、Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸，或B、聚殼聚糖-4-氨基吡咯-2-羧酸。
2.權(quán)利要求1所述肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)的合成方法，其特征在于：
A、Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸的合成：
（1）介質(zhì)活化：100?g?Sepharose?CL?4B用10倍量的去離子水-記為體積V-洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于50?mL緩沖液，40℃搖床震蕩2.5?h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次V體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，再抽干成濕餅狀，得活化的Sepharose?CL?4B；
所述緩沖液為0.8?M?NaOH、20%二甲亞砜和10%環(huán)氧氯丙烷的溶液，下同；
（2）接間隔臂乙二胺：活化的Sepharose?CL?4B層析介質(zhì)懸浮于100?mL去離子水中，按照1:2的摩爾比例加入乙二胺，凝膠在攪拌下60?℃恒溫12?h；用去離子水清洗；所得氨基-Sepharose?CL?4?B再次懸浮在50mL的緩沖液中，40℃搖床震蕩2.5?h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次V體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，再抽干成濕餅狀，獲得活化的氨基-Sepharose?CL?4B介質(zhì)；
（3）連接親和配體：稱取1g?4-氨基吡咯-2-羧酸，溶解于80?mL去離子水中，加入已抽干的活化氨基-Sepharose?CL?4B介質(zhì)，在50-60℃振蕩24?h，反應(yīng)過程中時(shí)常檢查pH，用1M?NaOH使溶液保持在11-12之間；反應(yīng)完畢，用500?mL去離子水充分洗滌，抽干，得Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸；
B、聚殼聚糖-4-氨基吡咯-2-羧酸的合成
（ⅰ）介質(zhì)活化：100?g聚殼聚糖用10倍量的去離子水-記為體積V-洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于50?mL?緩沖液，40?℃搖床震蕩2.5?h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次V體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀，得活化的聚殼聚糖介質(zhì)；?
（ⅱ）接間隔臂乙二胺：活化的聚殼聚糖介質(zhì)懸浮于500?mL?0.1M?NaOH溶液，加入20?mL乙二胺溶液，凝膠在攪拌下30?℃恒溫12?h；用去離子水清洗；所得NH2-聚殼聚糖懸浮在50?mL?緩沖液中，40?℃搖床震蕩2.5?h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次V體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀，獲得活化的氨基-聚殼聚糖介質(zhì)；
（ⅲ）連接親和配體：稱取1?g?的4-氨基吡咯-2-羧酸，溶解于80?mL去離子水中，加入已抽干的活化氨基-聚殼聚糖介質(zhì)，50-60?℃振蕩24?h，反應(yīng)過程中時(shí)常檢查pH，用1M?NaOH使溶液保持在11-12之間；反應(yīng)完畢，用500?mL?去離子水充分洗滌，抽干，得聚殼聚糖-4-氨基吡咯-2-羧酸。
3.一種利用權(quán)利要求1所述的肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于，將含有肌氨酸氧化酶的溶液流經(jīng)所述肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)進(jìn)行親和吸附，然后采用清洗液沖洗所述吸附后的肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)，最后用洗脫緩沖液洗脫所述肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)上吸附的肌氨酸氧化酶，從而獲得純化的肌氨酸氧化酶；
（A）所述的含有肌氨酸氧化酶的溶液是采用基因工程方法獲得的肌氨酸氧化酶表達(dá)液；
所述肌氨酸氧化酶表達(dá)液是復(fù)制來自于玫瑰紅嗜熱菌（Thermomicrobium?roseum?DSM?5159）的肌氨酸氧化酶基因SEQ?ID?NO:?1，并由大腸桿菌（Escherichia?coli）JM109?表達(dá)得到；
（B）所述親和吸附的條件為pH?7.5~8.7，電導(dǎo)率為2~5?mS/cm；
（C）采用清洗液沖洗所述肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)的清洗條件為pH值7.5~8.7，電導(dǎo)率5~10?mS/cm；
（D）用洗脫緩沖液洗脫所述肌氨酸氧化酶親和介質(zhì)上吸附的肌氨酸氧化酶的洗脫條件為pH值8.5~9.5，電導(dǎo)率40~80?mS/cm。
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