[發(fā)明專利]耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）疫苗重組蛋白抗原I1C及制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310021212.3
• 申請日: 2013-01-21
• 公開（公告）號: CN103087198A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒全明;樊紹文;曾浩;馮強;吳翼;蔡昌芝;郭鷹
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶原倫生物科技有限公司;中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/085;A61P31/04;G01N33/68;C12R1/19;C12R1/445
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于人的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）疫苗重組蛋白抗原I1C及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌指的是對惡唑類青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌，是一種存在人和動物的體表、鼻咽、會陰部及腸道的革蘭陽性菌,通常引發(fā)皮膚軟組織感染、菌血癥以及轉(zhuǎn)移并發(fā)癥，如肺炎、心內(nèi)膜炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎和骨髓炎。自1961年被英國學(xué)者Jevons首次發(fā)現(xiàn)，目前已成為全球ICU病房、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染經(jīng)久不愈，全身感染死亡率高達20%。因其傳播途徑廣泛，易暴發(fā)流行，又由于其致病性強，變異性大，且呈多重耐藥而成為臨床上治療的難點，被稱為“超級細菌”，這一特點使其極有可能作為未來軍事斗爭的細菌武器和生物恐怖戰(zhàn)劑。當(dāng)前，MRSA已與乙型肝炎、AIDS被列為世界三大最難解決的感染性疾病，并位居首位。

在國外，2005年美國的MRSA感染監(jiān)控資料顯示，美國全年的嚴重感染人數(shù)為9.4萬多人，致死病例約為1.9萬人，這一數(shù)字甚至超過艾滋病致死人數(shù)。在國內(nèi)，2010年中國CHINET細菌耐藥性檢測網(wǎng)結(jié)果顯示，國內(nèi)主要地區(qū)14所教學(xué)醫(yī)院，MRSA平均檢出率為51.7%，最高為77.6%；2008年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)結(jié)果顯示，國內(nèi)主要地區(qū)12所教學(xué)醫(yī)院MRSA平均檢出率為55.9%，最高為77.5%，屬于MRSA感染的嚴重國家之一。以上海為例，2004年該地區(qū)14所醫(yī)院金黃色葡萄球菌中MRSA的平均檢出率為63.9%，最高為86.5%，而2006年MRSA的平均檢出率為64.6%，最高達92.5%。由此可見，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不斷攀升，嚴重威脅人類健康。

目前，萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最后一道防線，但1997年以來耐萬古霉素的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌相繼被分離出來，可見抗生素的發(fā)展遠遠跟不上細菌耐藥性的發(fā)展，使得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌即將面臨無抗生素可治的嚴峻挑戰(zhàn)。因此，加強對MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美國研發(fā)的MRSA疫苗已進入Ⅲ期臨床試驗階段，因此，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、高效、安全、經(jīng)濟的MRSA疫苗對控制MRSA感染、耐藥性發(fā)展、生物恐怖防御和提高國際競爭力具有重要意義。

由于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌致病因子包括莢膜多糖、ClfA、IsdB、腸毒素、TSST-1、α-溶血素以及凝固酶等數(shù)十種，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護性抗原的難度較大，方法繁瑣，不利于疫苗的產(chǎn)業(yè)化制備。利用基因工程技術(shù)將菌體有效的保護性抗原進行克隆表達使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌鐵離子表面決定蛋白IsdB是一種外膜蛋白抗原，IsdB不僅是MRSA一個重要外膜錨釘?shù)鞍祝贛RSA定植粘附中期重要作用，同時它也是MRSA從宿主獲得鐵的一個主要工具。細菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，這些外膜蛋白作為抗體和免疫細胞攻擊的主要靶標(biāo)，可以介導(dǎo)對細菌最直接有效的殺滅作用，是決定免疫反應(yīng)是否對人體具有保護性的關(guān)鍵因素。ClfA是一種調(diào)節(jié)金葡菌與纖維蛋白素的結(jié)合，促進金葡菌同生物材料表面﹑血塊﹑血小板﹑內(nèi)皮表面結(jié)合的黏附素。在金葡菌與血小板的結(jié)合中ClfA也起著重要的作用，在導(dǎo)管誘導(dǎo)所致金葡菌心內(nèi)膜炎的動物模型中，其相互作用也很關(guān)鍵。

ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候選抗原。由于ClfA全蛋白具有纖維蛋白結(jié)合活性，不適宜做為疫苗候選抗原，本研究利用生物信息技術(shù)篩選到不能與纖維蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域C。同時篩選出IsdB的結(jié)構(gòu)域I1。通過理論設(shè)計及實踐優(yōu)化，選擇到能有效將兩者結(jié)合起來并使融合蛋白具有良好免疫活性的連接肽。最后形成I1C重組蛋白。目前尚未見使用ClfA、IsdB選擇一個亞單位的活性功能片段的融合蛋白作為免疫原性材料，制備MRSA雙價疫苗的報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的高耐藥性的問題，本發(fā)明提供一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）重組融合蛋白I1C，該融合蛋白純度高，表達量高，便于分離純化，高效安全。

本發(fā)明所述耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）重組融合蛋白I1C，由MRSA鐵離子表面決定蛋白IsdB的一個活性片段(I1)與ClfA抗原分子的一個活性片段(C)組成，活性片段I1與活性片段C通過連接肽融合而成。

重組蛋白I1C的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，氨基酸序列如SEQ?IDNO:2所示。