[發(fā)明專利]紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310018470.6
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103087186A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘇秀榕;周君;李曄;張春丹;李成華;劉艷;李振;張云云
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/14;C12N15/12;C12N15/70
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組鐵結(jié)合蛋白，具體涉及紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白及紐蟲的體外重組鐵結(jié)合蛋白的制備方法。

背景技術(shù)

鐵結(jié)合蛋白（鐵蛋白）是一種具有儲存數(shù)千鐵離子和數(shù)百磷分子能力的蛋白質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是由高度對稱性亞基所組合的蛋白質(zhì)，外殼可以包裹著由鐵磷化合物組成的鐵核。鐵核結(jié)構(gòu)起著供給和存儲鐵的“倉庫作用”，鐵蛋白的蛋白殼上含有兩種橫跨蛋白殼的隧道，即三相(X.Y.Z)物質(zhì)交換隧道和電子隧道，前者的作用供無機磷鐵及其他小分子進出，后者的功能起著接收及傳遞電子的作用。脊椎動物的鐵蛋白由兩種不同類型的亞基組成，即H和L亞基，L型亞基與H型亞基相互作用使氧化型鐵礦化為一個鐵核。。目前大部份是脊椎動物的重組鐵蛋白，如申請?zhí)枮镃N為200510048963.X的發(fā)明專利申請就公開了利用基因工程技術(shù)，通過人乳鐵蛋白基因的克隆、重組桿狀病毒的構(gòu)建、家蠶體內(nèi)表達(dá)和人乳鐵蛋白純化得到重組人乳鐵蛋白。也有無脊椎動物的重組鐵蛋白，如公開號為CN102051363的發(fā)明專利申請，則公開了文蛤鐵蛋白基因、編碼蛋白、體外重組產(chǎn)物等，通過文蛤RNA提取和純化、cDNA構(gòu)建及鐵蛋白基因的篩選、RACE獲得鐵蛋白基因序列，再利用鐵蛋白基因進行PCR擴增、克隆至表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌、LB培養(yǎng)劑培養(yǎng)、菌體用雞蛋清溶菌酶處理、超聲破碎、從包涵體體中純化得到目的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白及紐蟲的體外重組鐵結(jié)合蛋白的制備方法，該重組紐蟲鐵結(jié)合蛋白具有存儲鐵功能外，還具有富集重金屬和有機磷的功能。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白，該紐蟲重組鐵結(jié)合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。

紐蟲的體外重組鐵結(jié)合蛋白的制備方法，其步驟如下：

a、?RNA提取：取紐蟲體壁80-100mg速凍于液氮中，研磨成粉，用RNAiso?plus

提取試劑盒提取得到紐蟲RNA，具體提取方法依照提取試劑盒說明書進行操作；?

b、cDNA合成：將紐蟲RNA用cDNA試劑盒合成cDNA，具體合成方法依該cDNA試劑盒說明操作，得到cDNA文庫質(zhì)粒，然后用下述引物對合成的cDNA進行PCR擴增，上游引物：5’-?AAGGGCATGA?AGGTCCAAGA?GGG?-3’，?下游引物：5’-?GTGGAAGCCA?TCAGGGAA-3’；?PCR擴增體系：cDNA文庫質(zhì)粒：1.0μL，10×PCR?緩沖液：2.5μL，MgCl₂（25mM）：2.0μL，dNTP（10mM）：2.0μL，上游引物（10μM）：1.0μL，下游引物（10μM）：1.0μL，DNA聚合酶（5U/μL）：0.2μL，超純水：15.3μL，總體積：25.0μL。擴增條件：94℃?5?min、94℃?30?s、58℃?3?s0、72℃?1min?，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10?min；擴增反應(yīng)后，用回收試劑盒回收電泳后的PCR產(chǎn)物，然后PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.Coli?DH5α后，在含有氨芐濃度為80-100mg/L的LB平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-12h，挑取陽性克隆菌落，得到陽性克隆質(zhì)粒；陽性克隆質(zhì)粒測序后用BLAST軟件進行比對，確定質(zhì)粒含有紐蟲鐵結(jié)合蛋白基因；?